金属离子对蛋白剪接的抑制作用及xafs方法分析cuhis2水溶液的配位方式-inhibitory effect of metal ions on protein splicing and xafs method analysis of coordination modes of cu his _ 2 aqueous solution.docxVIP

摘 要摘 要本文首先对蛋白剪接作用及蛋白内含子(intein)做了文献调研。分别介绍 了蛋白剪接（splicing）作用及蛋白剪接反应机理、蛋白内含子的命名、分布、 保守基序、结构域、种类、生物学功能和应用几个方面。分析了近些年来关于 蛋白内含子研究的状况和进展，为课题的开展做了基础铺垫，指导了后续实验。文章着重于蛋白剪接抑制剂的筛选和作用机理的研究，分别用体内和体外 报告体系对几种的蛋白剪接抑制剂进行了活性测试。顺铂的抑制效果最好，其 体外抑制效果为IC50 值为2.5μM；在两种体内报告体系中的抑制效果表现分别 为IC50值为7.71μM和18.47μM。对于体外抑制效果我们还进行了恢复，用GSH基 本可以让抑制效果恢复，证明这是一种可逆的抑制。针对金属和蛋白内含子的作用机理，我们还通过晶体衍射的方法进行研究。 首先需要生长晶体，采用的方法为常规的气相扩散的方法，即坐滴和悬滴。初筛得到出晶的条件后，要通过一系列的优化，即改变母液的 pH、盐浓度和沉淀剂比例，以得到可以用 于衍射的晶形较好的单晶。这部分工作尚在进行当中。因为在二价铜离子对蛋白剪接抑制过程中，蛋白内含子 N 端第 73 位的组氨酸可以与铜离子配位，故我们用 XAFS 方法对溶液状态下的 Cu(His)2 的配位模式进行研究，期望得到铜 与组氨酸配位的准确信息。另外 Cu(His)2 在人体血液中与血清白蛋白共同参与维持血液中 铜离子平衡，故研究生理 pH 下 Cu(His)2 的配位，以及 Cu(His)2 随 pH 变化配位模式变化也 是有一定意义的，对此我们也做了一些文献调研。通过拟合 XAFS 的结果，我们得到 pH2.8、 4.5、7.4 和 9.8 下的配位模式和配位原子及键长。关键词：蛋白剪接 蛋白内含子 蛋白剪接抑制剂 XAFS 蛋白晶体IAbstractABSTRACTIn this dissertation, we study several aspects about protein splicing in Mycobacterium tuberculosis RecA intein. First of all, we made a brief review about protein splicing and the internal protein (intein). It includes the definition of protein splicing, the mechanism of protein splicing, the critical amino acids in protein spling, the nomenclature of intein, inteins’ distribution, the classification of inteins, the conserved amino acids and motifs in intein, and the application of inteins.We screen several protein splicing inhibitors, using both in vivo and in vitro screening reporter system. The in vivo reporter system are TS reporter system and ALSII reporter system, the in vitro reporter system is GFP-RecA intein reporter system. The results for complex P-0810 is that the IC50 in vitro is 2.5 μM, while the inhibition of inteins plicing using TS reporter system has the IC50 of 7.71μM and in ALSII reporter system the IC50 is 18.47μM. For the in vitro system we used GSH to consume complex P-0810, and the inhibition can be attenuated. So we concluded that the inhibition of splicing is reversible.In order to get a better understanding of metal-protein interaction, we planned to do x-ray diff