辣椒多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆及功能分析-cloning and functional analysis of polygalacturonase inhibitor protein gene in capsicum annuum l..docxVIP

中文摘要病原菌与植物互作过程中，可分泌多种细胞壁降解酶，其中多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases，PGs）是主要的降解酶之一，主要是通过降解细胞壁的重要组分——果胶而破坏细胞壁，导致寄主产生坏死症状或加速病程发展，同时为病原菌的生长和繁殖提供糖源等营养物质。多项研究表明PG是一种重要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonaseinhibitingprotein，PGIP）是一种富含亮氨酸重复（LRRs）的特异性细胞壁结合蛋白，能专一地抑制内切型PGs的活性，与PGs互作过程促进了植物体内产生与积累寡聚半乳糖醛酸（oligogalacturonide，OGs），参与植物的抗病信号传递，增强了植物的抗病性，有效地阻断病菌侵染和抑制相应病程的发生与发展；同时PGIP与病原菌分泌的PGs结合，抑制了PGs的活性，减少了PGs对植物细胞壁的降解，有助于维护植物细胞壁的完整性，进而减缓病原菌的定殖与繁殖，相应的增强植物的抗病性，其抑制PGs活性的能力与植物的抗病能力呈正相关。植物病害严重影响作物的质量和产量，长期以来传统的防治方法很难取得满意的效果。鉴于PGs是一种重要的致病因子，且参与病原菌侵染植物的关键过程，而PGIPs又是一种特异抑制PGs活性的重要因子，多项研究表明，将PGIP基因导入同源或异源植物体中，其稳定表达后将大大增强宿主植物的抗病性。因此可以通过PGIP在寄主体内的过量表达来抑制病原菌分泌的PGs的活性，从而增强寄主的抗病性。本课题结合已有的研究基础，具体开展内容如下：（1）辣椒（CapsicumannuumL.）PGIP基因克隆及生物学分析。从辣椒中成功克隆到三个PGIP基因，命名为CaPGIP，均包含PGIP基因特有的富含亮氨酸重复（LRRs）结构域，并且系统学分析界定了辣椒该类基因在进化中的分类地位。（2）三个CaPGIP基因mRNA的表达量差异分析。用多种胁迫因子处理4-6叶期辣椒叶片，荧光定量PCR检测CaPGIP基因的相对表达量升高，外界的刺激激活了植物体的防卫反应，PGIP参与了植物体内抗逆信号的转导。（3）三个CaPGIP纯蛋白对多种PGs活性的抑制效果分析。建立CaPGIP基因的原核表达系统，成功表达，并通过亲和层析纯化出三个CaPGIP基因的纯蛋白，采集分离到多种植物病原真菌和卵菌菌株，并用果胶诱导得到上述菌株的细胞壁降解酶（其中主要包括多聚半乳糖醛酸酶PGs），体外条件下，通过紫外分光光度法及琼脂扩散法检测，三个CaPGIP纯蛋白对PGs活性有不同程度的抑制效果。（4）辣椒体内CaPGIP基因沉默后对其抗病性的影响分析。构建CaPGIP基因的沉默表达载体pTRV2-CaPGIP1/2和pTRV2-CaPGIP3，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）机理，将辣椒体内的CaPGIP基因部分或整体进行沉默，荧光定量PCR检测到三个CaPGIP基因表达量明显降低，将同一转化植株接种强致病亲和辣椒疫霉菌株SD33游动孢子悬浮液，三到四天后观察，发现处理组比对照组表现病斑扩大症状。（5）转CaPGIP基因烟草抗病性检测。构建了CaPGIP1基因的转基因植物表达载体pROKⅡ-CaPGIP1，使外源基因在模式植物烟草体内达到稳定表达，通过组织培养获得转基因烟草的T0代，PCR检测获得阳性植株，然后接种烟草炭疽病菌和烟草赤星病菌，四天后观察，发现转基因阳性植株表现出比野生型更强的抗病性。由此可见，PGIP对PGs活性的抑制具有广谱性和特异性，且PGIP基因在寄主体内的过量表达确实起到增强其抗病性的效果，为后续开展辣椒转PGIP基因增强抗卵菌病害能力，甚至进行农作物或经济作物抗性品种改良和培育抗病新品种奠定基础。关键词：辣椒；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；富含亮氨酸重复；病毒诱导的基因沉默；转基因AbstractPathogenscansecreteavarietyofcellwalldegradingenzymeswheninteractingwithplant,polygalacturonicacidenzyme(Polygalacturonase,PG)isoneofthemaindegradingenzyme,whichcandegradepectintheimportantcomponentofthecellwallandleadtonecrosisoracceleratedprogressionofsymptomsofhost.Theprocesscanprovidecarbohydratesourcesnutrientsforthegrowthandreproductionofpathogenic.AnumberofstudieshaveshownthatPGis