雷帕霉素抑制人骨肉瘤mg-63细胞周期及cyclind1表达的实验研究-experimental study on rapamycin inhibiting cell cycle and cyclin d1 expression in human osteosarcoma mg - 63 cells.docx

1引言骨肉瘤作为骨科一种比较常见的原发性恶性肿瘤，好发于青少年人群，好发部位为长骨干骺端，其恶性程度比较高，死亡率占青少年恶性肿瘤死亡率的第二位。一项回顾性分析表明，在肿瘤化疗药物应用以前，包括在美国梅奥医学中心接受治疗的患者，仅通过手术切除肿瘤治疗的患者术后长期生存率仅为17.8%[1]。随着近年来保肢手术结合基于甲氨蝶呤、顺铂、阿霉素、异环磷酰胺的新辅助化疗方法在临床上的应用，对于早期未发生肺转移的骨肉瘤患者，其预后有了较大的改善，术后5年生存率上升到50%～70%[2]，然而仍有多达30%的患者会发生肺转移。对于那些早期发生肺转移、对化疗药物不敏感以及术后复发的患者，现有的治疗方法预后不佳，因此人们都在努力探寻更有效的治疗骨肉瘤的新方法，并陆续发现了一些具有抗肿瘤作用的新药物，如雷帕霉素(rapamycin)、双膦酸盐、色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derivedfactor，PEDF）等。雷帕霉素又名西罗莫司，是一种由吸水链霉菌产生的大环内酯类抗生素，最初发现其具有抗真菌作用[3]，后人们又发现其具有免疫抑制作用，在临床上应用于器官移植术后抗免疫排斥反应已有十几年的历史。雷帕霉素还具有抑制血管内皮细胞增生作用，临床上已将其包被于金属支架表面制成雷帕霉素药物洗脱支架用于冠状动脉狭窄患者，防止术后由于血管内皮细胞增生导致的支架内再次狭窄。近年来研究表明雷帕霉素还具有抗肿瘤作用，能抑制多种肿瘤增殖，包括胰腺癌[4]、乳腺癌[5]、肝癌[6]等，目前国内在雷帕霉素抑制骨肉瘤方面未见相关文献报道。本实验主要通过研究雷帕霉素对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖、周期以及细胞周期蛋白D1(CyclinD1)基因表达的影响，来探讨雷帕霉素抑制骨肉瘤细胞增殖及周期的可能机制，为骨肉瘤靶向治疗提供新的研究方向。2材料与方法2.1实验材料2.1.1主要材料及试剂（1）人骨肉瘤细胞株MG-63购于武汉大学中国典型培养物保藏中心（2）RPMI-1640培养液：Gibco公司（3）胎牛血清：杭州四季青公司（4）0.25%胰蛋白酶溶液：武汉博士德公司（5）雷帕霉素原料药：天津新美科技有限公司（6）CellCountingKit-8(CCK-8)：上海同仁化学研究所（7）碘化丙啶(PI)：Sigma公司（8）Trizol试剂：Invitrogen公司（9）RT-PCRKit：Toyobo公司（10）RNAPCRKit：Fermentas公司（11）DNAMarker：杭州博日科技有限公司（12）GoldviewI型核酸染色剂：北京索莱宝公司（13）PCR引物合成：Invitrogen公司（14）兔抗人CyclinD1抗体：Bioworld公司（15）即用型SABC试剂盒：武汉博士德公司（16）DAB试剂盒：北京中杉金桥公司（17）磷酸盐缓冲液晶体（PBS）：武汉博士德公司2.1.2主要仪器设备（1）ShellLab2300恒温二氧化碳培养箱：美国Shell-Lab公司（2）YJ-1450超净工作台：苏州净化设备厂（3）IMT-2倒置显微镜：日本Olympus公司（4）42A型台式低速离心机：北京白洋医用离心机有限责任公司（5）101-3电热鼓风干燥箱：上海沪沁仪器设备有限公司（6）ELx800酶标仪：美国宝特公司（7）单道可调移液器：德国Eppendrof公司（8）FACSCalibur流式细胞仪：美国BectonDicknson公司（9）TGL-16R冷冻高速离心机：珠海黑马医学仪器有限公司（10）TpersonalPCR仪：德国Biometra公司（11）DU640紫外分光光度计：美国Beckman公司（12）MDF-V5186S超低温冰箱：日本Sanyo公司（13）Bio-Print1000电泳凝胶成像分析系统：法国Viber公司（14）B×50显微镜及照相系统：日本Olympus公司（15）培养瓶、细胞计数板、吸管等：均为国产玻璃仪器2.1.3溶液配制（1）含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液：胎牛血清放置于4℃冰箱解冻后，无菌分装。使用前按1：9比例将血清加入RPMI-1640培养液中混匀即可，培养液于4℃冰箱保存，血清于-20℃冰箱保存（2）0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）：取购买的PBS晶体一包溶于2L双蒸水中，测定调节PH值至7.4，分装于干净玻璃瓶中，高压蒸汽灭菌后保存（3）0.05%PI染液：称取少量PI，溶于PBS溶液中配成0.5%PI母液，分装在EP管中于-20℃冰箱保存，使用前用PBS稀释成0.05%PI染液（4）5×TBE电泳缓冲液（贮存液）：称取54gTris碱、27.5g硼酸、3.72gEDTANa2溶解于1L双蒸水中，调节pH为8.3。使用时稀释为0.5×TBE工作液（5）1.5%琼脂