雷州黑鸭pax3、dcn和mstn基因在胚胎期骨骼肌中差异性表达分析-differential expression analysis of pax 3, dcn and mstn genes in skeletal muscle of leizhou black duck during embryonic stage.docxVIP

雷州黑鸭Pax3、DCN和MSTN基因在胚胎期骨骼肌中差异性表达研究摘要鸭肌纤维的生长发育情况与鸭肉品质性状密切相关，在肌纤维的形成以及生长发育过程中，Pax3、DCN和MSTN基因对骨骼肌的生理特性起到决定性作用。为进一步了解Pax3、DCN和MSTN基因与雷州黑鸭骨骼肌形成的密切关系，以及在骨骼肌形成过程中相互之间的功能联系，为改善雷州黑鸭肉品质打下分子基础。本研究对雷州黑鸭第8、13、18、23、28天胚胎的胸肌和腿肌进行组织切片观察，并采用QRT-PCR与western-blot试验方法检测了Pax3、DCN和MSTN基因在以上各阶段胸腿肌中mRNA与蛋白的发育性表达情况。同时用QRT-PCR法检测了雷州黑鸭28胚龄时Pax3、DCN和MSTN基因在心、肝、脾、肺、肌胃、小肠、脑、胸肌、腿肌中mRNA的差异性表达量。本研究采用了RT-PCR法对雷州黑鸭DCN基因序列的CDS区全长进行了克隆，并构建了pcDNA3.1myc-His(-)A-DCN真核表达载体。研究结果表明：（1）从不同胚胎期的胸肌、腿肌组织切片可见，胚胎发育过程中雷州黑鸭骨骼肌的形成经历了成肌细胞，多核肌管，肌纤维形成的过程。雷州黑鸭胚胎期腿肌的发育明显早于胸肌，且腿肌为早熟部位，胸肌为晚熟部位。（2）本研究采用荧光定量PCR的方法，对胚胎期雷州黑鸭Pax3基因在骨骼肌中的时空性差异性表达进行检测。结果表明，在不同胚胎期胸肌组织中，Pax3基因mRNA表达水平在23d时达到高峰，在18d时表达量最少；在腿肌组织中Pax3基因mRNA表达水平均在28d时达到高峰，在18d时表达量最少；在28胚龄期的雷州黑鸭内脏组织中，Pax3基因在腿肌中的表达水平最高，在脾脏中第二，紧接着是胸肌。并采用western-blot的方法，对Pax3基因在雷州黑鸭胚不同胚胎期的胸肌、腿肌组织中蛋白表达水平进行检测，结果表明，在胸肌组织中，Pax3蛋白在23胚龄时表达量最高，13胚龄时最低；在腿肌组织中28胚龄时表达量最高，8胚龄时表达量最低。（3）胚胎期雷州黑鸭DCN基因在骨骼肌中的时空性差异性表达进行检测。结果表明，在不同胚胎期胸肌组织中，DCN基因mRNA表达水平在28d时达到高峰，在8d时表达量最少；在腿肌组织中DCN基因mRNA表达水平均在28d时达到高峰，在8d时表达量最少；在28胚龄雷州黑鸭内脏组织中，DCN基因在胸肌中的表达量第一，第二是腿肌。并采用western-blot的方法，对DCN基因在雷州黑鸭胚不同胚胎期的胸肌、腿肌组织中蛋白表达水平进行检测，结果表明，DCN蛋白在胸肌组织中23胚龄表达量达最高，在13胚龄时最低；在腿肌组织中28胚龄时表达量最高，8胚龄时表I达量最低。（4）本研究采用荧光定量PCR的方法，对胚胎期雷州黑鸭MSTN基因在骨骼肌中的时空性差异性表达进行检测。结果表明，在不同胚胎期胸肌组织中，MSTN基因mRNA表达水平在23d时达到高峰，在8d时表达量最少；在腿肌组织中MSTN基因mRNA表达水平在28d时最高，在13d时表达量处于最低谷；在28胚龄雷州黑鸭内脏组织中，MSTN基因在腿肌中的表达量最高，第二是胸肌。并采用western-blot的方法，对MSTN基因在雷州黑鸭胚不同胚胎期的胸肌、腿肌组织中蛋白表达水平进行检测，结果表明，MSTN蛋白在胸肌组织中23胚龄时表达量达最高，8胚龄时最低；在腿肌组织中28胚龄时表达量最高，8胚龄时表达量最低。（5）本研究成功的克隆雷州黑鸭DCN基因CDS区全长，并通过生物信息学分析发现，雷州黑鸭的DCN基因与鸡的遗传距离最近。对DCN蛋白质结构进行预测时，发现雷州黑鸭DCN蛋白不存在跨膜结构，有1处信号肽位点，该蛋白不是分泌型通路信号肽，其氨基酸序列为亲水性，有13个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。DCN蛋白包含有3个LRR8、1个富含亮氨酸重复N端结构域和1个属于核糖核酸酶抑制剂的亚家族的富含亮氨酸重复序列，参与胚胎期骨骼肌的形成调控；并且对DCN真核表达载体pcDNA3.1myc-His(-)A-DCN进行了构建。关键词：雷州黑鸭，骨骼肌，切片，基因表达，克隆DifferentialexpressionresearchofLeizhoublackduckPax3,DCNandMSTNgeneinembryonicskeletalmuscletissueAbstractDuckmusclefibergrowthanddevelopmentiscloselyrelatedtomeatqualitytraits,Intheformationandgrowthofmusclefibersduringdevelopment,Pax3,DCNandMSTNgeneplaysadecisiveroleinph