粒细胞集落刺激因子调控microrna-granulocyte colony stimulating factor regulates microrna.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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粒细胞集落刺激因子调控microrna-granulocyte colony stimulating factor regulates microrna.docx

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粒细胞集落刺激因子调控microrna-granulocyte colony stimulating factor regulates microrna

粒细胞集落刺激因子调控microRNA-146a/CXCR4表达在预激方案中的作用摘要研究目的随着诊疗技术的进步，急性髓细胞白血病（AML）化疗缓解率已明显提高，但老年、复发/难治性、继发性AML患者的预后仍较差。由阿糖胞苷、阿霉素、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）组成的CAG方案已广泛应用于这些患者，并取得较好的疗效。但G-CSF在预激方案中的作用仍不甚明确，本文将对潜在的G-CSF削弱基质细胞介导的白血病耐药及可能机制进行研究。设计和方法通过建立HS-5/HL-60共培养体系，模拟骨髓基质细胞与白血病细胞之间的相互作用。利用Transwell实验研究细胞趋化、共培养技术研究细胞粘附、CCK-8法检测活力、AnnexinV检测凋亡、流式细胞术检测细胞表面膜蛋白、蛋白印迹法检测总蛋白、实时定量PCR（RT-PCR）检测基因表达等，研究了基质细胞对白血病细胞有无保护作用、G-CSF能否打破这种保护作用及相关的信号机制。实验结果第一部分HS-5细胞能够趋化、粘附HL-60细胞，而G-CSF和（或）CXCR4特异性拮抗剂AMD3100能够部分阻断此过程。与HS-5上清（非直接接触）或HS-5细胞（直接接触）共培养时，HL-60细胞凋亡减少（包括自然凋亡和药物诱导凋亡）、活力增加；G-CSF和（或）AMD3100能部分逆转HS-5的保护作用（凋亡增加、活力降低）；G-CSF和AMD3100具有协同效应；与非直接接触共培养相比，直接接触共培养对HL-60的保护作用更加明显。HL-60细胞单独培养时，G-CSF和（或）AMD3100对HL-60细胞的活力、凋亡无明显影响。第二部分G-CSF作用于HL-60细胞后，能够明显降低HL-60细胞膜表面CXCR4蛋白、总CXCR4蛋白和CXCR4mRNA表达，同时上调microRNA-146（amiR-146a）；CXCR4与miR-146a之间存在负性相关关系。AMD3100仅降低膜表面CXCR4表达，而对总CXCR4蛋白、CXCR4mRNA和miR-146a表达无明显影响。第三部分G-CSF在上调miR-146a、降低CXCR4mRNA表达同时，上调NF-κBP50、P65mRNA表达；与单独G-CSF处理相比，NF-κB抑制剂血根碱联合G-CSF处理能够部分逆转G-CSF的作用；血根碱单独处理对NF-κBP50、P65、miR-146a和CXCR4mRNA无明显影响。G-CSF处理后，NF-κBp50、p65、p-IκB蛋白表达增加。结论G-CSF可通过激活NF-κB信号通路上调miR-146a表达，从而降低HL-60表面的CXCR4表达而阻断CXCR4/SDF-1α信号轴，最终打破基质细胞对HL-60的保护作用而使其对化疗药物更加敏感。关键词G-CSF，CXCR4/SDF-1α轴，耐药，microRNA-146a，NF-κBTheroleofgranulocytecolony-stimulatingfactorregulatingmicroRNA-146a/CXCR4expressioninprimingchemotherapyregimentAbstractObjectiveWiththeprogressofdiagnosisandtreatment,theresponseratetochemotherapyhasbeenimprovedobviously,buttheoutcomeofacutemyeloidleukemiainolder,relapsed/refractory,secondarypatientsisdismal.Thecytarabine,aclarubicinandG-CSF(CAG)protocolhasbeenwidelyusedinthesepatientsandhasbeenachieveddramatictherapeuticefficacy,whiletheunderlyingmechanismsarestillnotveryclear.HereweinvestigatedthepotentialabilityofG-CSFtoovercomestromal-mediateddrugresistanceandanalyzedtheunderlyingpossiblemechanism.DesignandMethodsTwokindsofHS-5/HL-60co-culturemodelshavebeenestablishedtoimitatetheinteractionsbetweenstromalcellsandleukemiacells.ThenweassessedthemigrationandadhesionabilitiesofHL-60cell