链孢粘帚霉hl11寄生核盘菌菌核相关基因的研究-study on sclerotium related genes of gliocladium sp. hl11 parasitized by gliocladium sp..docxVIP

本文是“863”计划项目“微生物杀菌剂研究与产品创制” 和转基因重大专项“抗大豆菌核病重要基因克隆及功能验 证” （课题编号：2011AA10A205；2009ZX08009-0898） 的部分研究成果 I I 链孢粘帚霉 HL-1-1 寄生核盘菌菌核相关基因的研究 摘 要 链孢粘帚霉 Gliocladium catenulatum 是一类分布广泛的丝状真菌，可以寄生多种植 物病原真菌，具有较大的生防潜力。为研究链孢粘帚霉 HL-1-1 寄生核盘菌菌核的相关 基因，对本实验室前期构建的差异表达 cDNA 文库中序列进行测序和比对分析，采用荧 光定量 PCR 技术对在菌核粉诱导条件下与寄生相关基因的表达量进行定量监测，运用 RACE 技术获得了三条与寄生作用相关基因的序列全长。 从差异表达的 cDNA 文库中随机挑取 504 个克隆进行测序，去掉载体序列和小于 100 bp 的序列，得到 303 条高质量 ESTs 序列，平均长度为 423 bp。经过拼接后，获得 128 条单值基因，其中包括 23 条重叠群（contiges）和 105 条单拷贝 EST（singletons）。 将得到的单值基因用 BLASTx 程序在 NCBI 的非冗余（NR）数据库进行序列分析，其 中 32 个序列是已知功能基因，其中细胞色素 P450、核糖体蛋白、血红素加氧酶、脂滴 包被蛋白以及内切葡聚糖酶等都与机体在胁迫条件下的应答反应有关；来源于不同物种 的功能未知基因有 85 条；11 条基因与数据库中没有同源性，代表新基因片段。 为明确功能未知基因 6-61、8-13 和内切葡聚糖酶基因 8-20 在菌寄生菌链孢粘帚霉 HL-1-1 寄生核盘菌菌核过程中的作用，本研究应用 SYBR Green Ⅰ法对三个基因进行 real-time PCR 法进行相对表达的定量监测，结果表明：未知功能基因 6-61 在菌核粉的 诱导下表达量呈下降趋势，且在 96 h 达到最低；基因 8-13 的表达量呈现先下降后上升， 在 96 h 的表达量超过诱导前的表达量；内切葡聚糖酶基因 8-20 的表达水平随菌核粉诱 导培养时间的延长而升高，在 96 h 后表达量升高 9 倍。因此，相对表达量的定量监测表 明这三个基因参与了菌寄生过程。 通过 RACE 技术获得基因 6-61、8-13 和 8-20 的全长序列，并通过生物信息学方法 进行初步分析，其中基因 6-61cDNA 序列全长 1247 bp（Genbank 登录号 JQ811207），可 以编码 129 个氨基酸，与绿僵菌 Metarhizium acridum CQMa 有较高同源性，属于功能未 知蛋白；基因 8-13 可编码 cDNA 序列全长 1308 bp（Genbank 登录号 JQ811208），可以 编码 176 个氨基酸，与青霉菌 Penicillium marneffei ATCC 18224 有较高同源性，但属于 功能未知蛋白；基因 8-20 cDNA 序列全长 1479 bp（GenBank 登录号 JQ728996），开放 阅读框（ORF）长 1269 bp，编码 423 个氨基酸，与木霉 Trichoderma sp. SSL 内切葡聚 糖酶的同源性高达 94%，命名为 eg8-20。 采用同源重组原理构建链孢粘帚霉 HL-1-1 功能未知基因 8-13 和内切葡聚糖酶基因 8-20 的敲除载体，并成功获得敲除转化子 UD-6 和 ED-3。以野生型菌株为对照，对转化 子进行表型分析，结果显示：基因敲除转化子的生长速度、产孢量与野生型无显著差异。 室内生物测定表明，转化子能够抑制核盘菌菌核萌发，但其侵染能力明显减弱，UD-6 寄生级别由野生型菌株的四级降为三级，而 ED-3 由野生型菌株的四级降为二级，证明 基因 8-13 和 8-20 在链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核过程中发挥着重要的作用。 关键词：链孢粘帚霉；内切葡聚糖酶；基因敲除转化子；荧光定量 PCR；菌寄生 II II Mycoparasitism-associated Genes of Gliocladium catenulatum HL-1-1 Associating with Sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum Abstract Gliocladium catenulatum, which distributes worldwide, is an important mycoparasite and has showed great potential for biocontrol of many plant fungal pathogens. In order to invest