foxp3 sirna转染慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞增强乙肝免疫的研究-study of foxp 3 sirna transfection on peripheral blood lymphocytes of patients with chronic hepatitis b to enhance hepatitis b immunity.docxVIP

上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 PAGE PAGE 16 第一章 特异性 siRNA 对 CHB 患者外周血淋巴细胞 FoxP3 的 抑制作用 1.1 引言 据统计，全世界大约 3.5 亿 HBV 携带者，我国就是个乙肝大国。临床上采 用干扰素和抗病毒药物治疗 CHB，但仅有三分之一的患者对这种治疗有反应， 因此许多研究者都在努力探索一种新的治疗乙肝方法。先前研究发现 RNAi 能有 效的抑制乙肝病毒的复制。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术是最近几 年发展起来的一种由特异性靶向作用的双链 RNA 介导的新的基因干扰技术[29]。 它的机制是由双链 RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引发的转录后基因静 默机制。其原理是：RNaseIII 核酶家族的 Dicer，与双链 RNA 结合，将其剪切 成 21 - 25nt 及 3端突出的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA），随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物（RNA - induced silencing complex，RISC）结合， 解旋成单链，活化的 RISC 受已成单链的 siRNA 引导，序列特异性地结合在靶 mRNA 上并将其切断，引发靶 mRNA 的特异性分解，从而阻断相应基因表达的 转录后基因沉默机制。最初在植物、线虫、果蝇被发现，接着它的家族成员逐渐 被发现。RNAi 是一种细胞防御方式，能够特异性地降解细胞内与之具有同源性 的 mRNA 序列，既能使生物抵抗内源寄生性核酸或外源病原体的致病性核酸还 可以调节细胞内编码基因的表达。由此推测 RNAi 是机体一种重要的抗病毒防御 系统，并说明 RNAi 在抗病毒感染特定基因功能研究及遗传表型分析等方面具有 巨大的潜力。近年来，RNAi 技术广泛应用到基因的功能、冗余基因的确定、药 物开发及基因治疗等研究中[30]。 本实验中，我们就采用 FoxP3 特异性 siRNA 干扰 CHB 患者 PMBC FoxP3 基因表达，通 real time PCR 和 western blot 试验，我们分别检测 siRNA 对 FoxP3 mRNA 和蛋白的抑制作用，从而保证下一步试验顺利进行。 1.2 材料和方法 1.2.1 病例选择 CHB 患者 20 例，男 13 例，女 7 例，年龄 19～56 岁，平均年龄（41.3±4.1） 岁。乙肝病毒学指标 HBsAg 阳性、HBeAg 或抗 HBe 阳性、抗 HBc 阳性，HBV DNA 阳性（ 1×105 copies/ml）。并排除非乙型肝炎病毒及其他病原体感染，不伴有自 身免疫性疾病、肿瘤等免疫有关疾病，近 6 个月未用过其它抗病毒药物和免疫调 节剂。 1.2.2 主要实验器材仪器 超净工作台 上海医疗器械厂 台式离心机 上海离心机械研究所 超低温离心机 德国 Kendro 公司 PE-2400 PCR 基因扩增仪 美国 PE 公司 二氧化碳培养箱 美国 Forma Scientific 公司 LD4-2A 离心机 北京医用离心机厂 电热恒温水浴加箱 上海精宏实验设备公司 PE-2400 PCR 基因扩增仪 美国 PE 公司 微量加样器 法国 Gilson 公司 倒置光学显微镜 Forma Scientific 公司 电泳仪 BIO-RAD POWER/PAC 200 电穿孔仪 美国 BioRad 公司 酶标仪 Multisken MK3 Thermo LAS-4000IR FUJIFILM 公司 1.2.3 分离淋巴细胞主要试剂 Ficoll 淋巴细胞分离液 Gibco公司 Hanks 液 参照《分子生物学技术》课本自配 1.2.4 电穿孔主要试剂 RPMI 1640 Hyclone 公司 FoxP3 siRNA（h） SantaCruz 公司 Control-siRNA SantaCruz 公司 台盼兰染色试剂 Santa Cruz 公司 DNA Ladder Promega 公司 PHA Sigma 公司 1.2.5 RT-PCR 主要试剂 Total RNA Isolation System Takara 公司 RT-PCR Master Mix 试剂盒 Takera 公司 ReverTra Ace-α-TM Takara 公司 Tris-HCI(pH:8.0) 10mmol/L TE 缓冲液 5×TBE 溶液 EDTA(pH:8.0) 1mmol/L 0.5M EDTA(PH:8.0) 20m1 Tris 碱 54g 1.2.6 western blot 主要试剂 1) 30%丙稀酞胺贮存液: 双丙稀酞胺 1g 丙稀酞胺 29 g 溶于