kl审审6作为胰腺癌标记物的研究-study on kl trial 6 as a marker of pancreatic cancer.docxVIP

准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。2)弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。3)每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。4)弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。5)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。6)取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。7)测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。8)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。3.2.2CA19-9测定标准品的稀释：60U/ml（5号标准品）120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液30U/ml（4号标准品）120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液15U/ml（3号标准品）120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液7.5U/ml（2号标准品）120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液3.75U/ml（1号标准品）120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液1)分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。2)弃去液体，甩干，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。3)每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。4)弃去液体，甩干，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。5)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.6)取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应。7)测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。8)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。3.3免疫组化1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：自配显色剂显色。14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15)脱水、透明、封片、镜检。3.4统计学处理实验结果以均数±标准差（x±s）表示，运用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料采用成组t检验、单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。通过绘制ROC曲线，依据曲线下面积（AUCareaundertheROCcurves）对比KL-6和CA19-9诊断胰腺癌的差异，确定KL-6诊断胰腺癌的最佳临界点（COPcutofpoint）。第四章结果4.1KL-6及CA19-9在胰腺癌病人血清的表达表1描述血清KL-6与胰腺癌临床因素的关系。结果显示血清KL-6浓度随肿瘤体积增大而升高(p＜0.01），女性病人均值（219.21±156.10）高于男性病人（107.81±89.86）。与年龄、有否淋巴结转移、远处转移、肿瘤分化程度以及肿瘤分期无关。表1血清KL-6与胰腺癌临床因素的关系SerumKL-6titer(U/ml)Factors(caseNo.)RangeMean±SDPAge(y)≤6262SexFemaleMaleTfactor＜5cm≥5cmNfactor01Mfactor01Histologicalgrade(SBR)c123TNMstagea,bStageI(22)StageII(87)StageIII(3)StageIV(14)10.09~425.9131.08~429.6935.72~429.6910.09~290.8510.09~290.8531.08~429.0938.39