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“基因综合开放实验”实验教学大纲 Gene comprehensive open experiments 课程中文名称：基因综合开放实验 课程英文名称：gene comprehensive open experiments 课程编码：BIEN3013 实验学时：48 学分：1.5 适用专业：生物工程大三学生及相关专业大三学生 先修课程：普通生物学、分子生物学、基因工程、基因工程实验、微生物学 开课学院：生命科学与技术学院 开课学期：第6学期 教材及实验指导书： 1、自编基因综合实验指导资料。 2、马建岗。基因工程原理。 西安，西安交通大学出版社，2006年。 3、J·姆布鲁克，D·W·拉塞尔著，黄培堂等译.《分子克隆实验指南》（第三版）。科学出版社，2002年。 一、实验课程简介 本课程是一门专业综合性、开放性实验课，内容以原核或真核表达系统的建立为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建，基因的转化、目的蛋白的表达以及表达产物的活性检测等基因工程上、下游部分所涉及的几个方面的实验内容。通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确和具体的认识，达到熟识、理解并掌握基因工程的实验原理和主要操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，在此基础上提高学生的开拓创新能力，为将来从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。 二、实验课性质、目的和任务 性质：专业综合实验课 　 随着分子生物学的迅猛发展，基因操作的方法与技术广泛渗透到现代生命科学的各个领域，成为生物技术的核心内容。通过“基因综合开放实验”课程的学习，使学生对基因工程有一个全方位的、比较系统的认识。通过一系列实验，加强学生动手能力，提高基本操作技能，为后续专业课程的开设打下基础。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。教学形式为学生自主实验为主，指导教师随堂指导、讲授、解答实验中遇到的问题。进入本课程的学生必需严格遵守实验室规则和纪律，认真对待每一次实验，实验前应充分准备，实验中认真操作、细心观察，真实记录实验结果并按要求完成实验报告。 4、实验报告要实事求是，侧重实验结果的分析和讨论，对不理想的步骤提出改良方案。 5、通过本实验相关内容的训练，掌握基因工程的原理、常用操作技术及注意事项、对基因工程产品研制的设计、制备及初步鉴定内容有个全面的掌握。 四、实验教学的内容与要求 实验教学的内容： 依据综合开放实验的特点和要求，考虑到实验内容的难易程度以及学生的兴趣爱好与可发挥的余地等因素，“基因综合开放实验”设立了两个大的题目 1、细胞因子原核表达系统的建立与表达； 2、一种新型蛋白（多肽）原核表达系统的设计、建立与表达。 同学们可任选其一完成。 实验内容提要： 实验内容提要： 主要试剂：质粒（pBR322/IL-2 、pBV221等）、各种核酸内切酶、连接酶、细菌、Taq DNA聚合酶、CaCl2溶液、各种缓冲液、SDS－PAGE等。 主要步骤： 1、目的基因的获取 　 1.1利用PCR技术扩增或酶切的方法获得目的基因 1.2人工合成法：如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 2、基因表达载体的构建 2.1载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因。 2.2功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。 2.3过程：细菌的培养、质粒的提取、酶切、连接与鉴定（PCR、酶切后电泳、测序等）。 3、将目的基因导入受体细胞 3.1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 3.2导入微生物细胞：用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。 3.3过程：用热休克法转化感受态细胞。转化感受态大肠杆菌的挑取、克隆、培养。 4、表达的目的基因的检测与鉴定 4.1 工程菌的诱导表达，包涵体提取，蛋白的纯化等， 　4.2 蛋白的SDS检测、生物活性检测、DNA分子杂交技术（检测目的基因、 分子杂交技术（检测mRNA）、 抗原抗体杂交技术（检测蛋白质）等。 实验类型：综合性 必做或选做：必做 使用的主要仪器：冰箱(-70℃,-20℃,4℃)、冷柜、温箱、烤箱、高压锅、紫外灯、超纯水制备器、超净台、CO2孵箱、天平、可调式微量移液管、pH计、分光光度计、电泳装置、层析装置、离心机，PCR仪，冻干机等。 五、成绩考核与评定方法 实验结束后，要求每个学生都要认真整理数据，对实验中的现象和问题进