微生物工程实验 学号09121047 曹运鹏.doc

黑曲霉发酵生产a-淀粉酶 09生物技术（2）班 曹运鹏 摘要：本实验按照一定的接种量向5L搅拌式发酵罐接种，并定时取样（每隔六小时取一次样），测量了发酵期间不同时段所取样品的PH、生物量、酶活、残糖等参数随时间的变化。发酵三天后放罐（大约66h），并分析了参数变化的原因，从而得到黑曲霉生产a-淀粉酶各种物质和理化性质的变化。 关键词：黑曲霉 发酵 a-淀粉酶 生物量 pH 酶活 一、材料和方法： 1.1材料 菌种：黑曲霉 PDA培养基：土豆200g（去皮）煮沸30min过滤，加糖20g，加水定容至1L. 碘液：称取0.5gI2 ,5.0gKI，研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，褐色溶剂瓶内保存，避免阳光直射。 稀碘液：原碘液稀释100倍，当天配制。 0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5g，加5ml缓冲液搅拌混合，再徐徐加入70ml煮沸的缓冲液，继续煮沸2min，冷切至室温，定容至100ml。需当天配制。 缓冲液：K2HPO4-KH2PO4 （pH为6.0） 发酵培养基（g/l）：淀粉200g；柠檬酸氢二氨100g；KH2PO4 15g;CaCl2 0.5g;七水硫酸亚铁0.05g；七水硫酸镁0.05g；水 5.0L，pH调至4.67；消泡剂 2.0mL。· 蒽酮试剂：溶解0.2g蒽酮于浓硫酸1L中，当天配制使用。 1.2方法 1.21菌种制备 先配制好PDA培养基，分装好，向各瓶中接入黑曲霉，170rpm摇瓶，28°c培养。 1.22设备 罐体结构：发酵罐上部有进料口、取样口、冷凝器和尾气过滤器，罐内有搅拌油、挡板、消泡靶。 水通道：分为冷却水和夹套水。冷却水可以使培养基降温，在发酵过程中，可以和夹套水一起控制发酵温度，夹套水为循环水，可以冷却也可以保温。 空气通道：空气经空压机压缩后，进入储气罐，经油水分离进入玻璃转子流量计，经过滤器后，进入罐底的空气分布器，尾气经罐顶过滤器后排出。 1.23空消 把发酵罐顶部管道全部夹住，用罩子罩住。打开蒸气发生器使夹套温度上升至70-80℃，然后打开发酵罐罐体阀门时蒸汽进入其中，当温度上升到121℃压强在0.1-0.15Mpa之间，稍微打开蒸汽出气口使体系温度和压强维持稳定，灭菌20min，结束后关闭蒸气管路，打开管道。 1.24实消 把配好的5L培养基由进料口加入，加2ml消泡剂，打开蒸汽管道，121°c霉菌30 min，灭菌结束后，打开冷凝水的通道，关闭蒸汽管道，打开空气管道。 1.25接种 待罐内温度降至28°c时，在进样口附近用酒精棉球点火，接入上述培养好的菌种。 1.26发酵 发酵过程中要注意罐内的温度、压强等参数是否正常，每隔6h取样一次 二、实验步骤 2.1残糖的测定[1] 本实验残糖的测定方法采取的是硫酸蒽酮法。设定的空白组是1.0mL的蒸馏水加入4.0mL的硫酸蒽酮溶液；实验组是1mL的稀释的残糖溶液加入4.0mL硫酸蒽酮溶液（三个平行组，并在冰水浴进行）。放置沸水中10min，在置于冰水浴中10min，在620nm处测吸光光度值。 2.2酶活的测定[2] 设立对照组，空白组和实验组。 空白组：0.5ml 蒸馏水+5.0ml 稀碘液； 对照组：5.0ml0.5%淀粉 40℃预热10min 加入0.5mL缓冲液5min 加入5.0mL稀硫酸终止反应 从反应体系中取出0.5ml的反应液加入5.0mL的稀碘液中 实验组：5.0ml0.5%淀粉 40℃预热10min 加入0.5mL酶液5min 加入5.0mL稀硫酸终止反应 从反应体系中取出0.5ml的反应液加入5.0mL的稀碘液中 对上述所得的溶液进行可见光分光光度计法测量，记下数值并标明稀释倍数D； 2.3生物量的测定[3] 每隔六个小时物一次样，每次取样10mL，对所取的样品进行离心5000rpm，5min；弃上清（用来测定酶活和残糖含量），将得到的沉淀物刮至培养皿中放到180℃的烘箱中1h。拿出来称量即为该批次的生物量（事先称好培养皿的重量）； 2.4 pH值得测定 将每次取得的发酵液用pH计进行测量，记录每次数据。 三、实验数据记录及数据处理，结果分析 3. 1生物量的变化 时间（h） 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 生物量(g) 0.003 0.026 0.041 0.156 0.052 0.064 0.072 0.082 0.105 0.041 0.09 0.102 生物量随时间的变化趋势 生物量： 其变化是随着时间的推移而逐渐增加的，其中18h的数据可能由于取样时后实验操作的错误导致很大的波动，应舍去。其中42-60h的波动可能由于取样时的误差，使得每次所取得10ml发酵液