二穗短柄草bdwrky2,bdwrky7和bdwrky43基因的克隆 表达分析和遗传转化-cloning, expression analysis and genetic transformation of bdwrky 2, bdwrky 7 and bdwrky 43 genes in brachypodium monnieri.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学 位论文是我个 人在导师指导下 进行的研究工 作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果 。对本文的研究 做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名： 日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。 不保密?。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要非生物逆境胁迫严重危害多种重要粮食作物（如小麦、大麦和燕麦等）的生长 和发育，进而严重降低其产量，因此迫切需要分离非生物逆境反应相关基因、并阐 明其功能，通过基因工程手段培育抗性作物新品种。二穗短柄草与小麦同属于冷季 型早熟禾亚科植物，遗传关系密切，且二穗短柄草 Bd21 的全基因组的测序工作已经 完成，基因克隆方便，是研究小麦功能基因的理想模式植物。转录因子 WRKY 是植 物十大转录调节因子之一，能够调节多种农艺性状，其功能涉及发育、代谢、衰老、 生物和非生物逆境胁迫等。因此，二穗短柄草 WRKY 基因的克隆、表达模式分析以 及遗传转化研究有望为麦类作物的遗传改良提供理论支持。本研究克隆了 BdWRKY2, BdWRKY7 和 BdWRKY43 基因，并对其进行了生物信息 学分析、表达分析、亚细胞定位分析、转化烟草以及初步的表型分析的工作。主要 研究结果如下：(1) 通过 检索二 穗短 柄草 WRKY 基 因 数据 库和 植 物基 因组 数 据库 ，获得 BdWRKY2, BdWRKY7 和 BdWRKY43 基因的 cDNA 和 DNA 序列，利用 Primer Premier 5.0 设计目的基因的特异性引物，成功克隆了 BdWRKY2/7/43 的基因。(2) 利用 DNAMAN 和 MEGA 5.0 对 BdWRKY 转录因子进行多序列比对和进化 分析，结果显示 BdWRKY2 属于 IIc 亚家族，BdWRKY7 属于 I 家族，BdWRKY43 属于 III 家族。(3) 利用半定量 RT-PCR 技术分析目的基因 BdWRKY2/7/43 的器官差异性和在非 生物逆境胁迫及分子信号处理下的表达水平。结果表明这 3 个基因在幼叶中的表达 量都比较高，且均响应多种非生物胁迫，具体表现为：BdWRKY2 基因受 PEG, ABA, NaCl, H2O2, heat 的诱导，表达上调；BdWRKY7 基 因受 PEG, NaCl, H2O2, heat, cold 的诱导，表达上调；BdWRKY43 基因受 PEG, heat 的 诱导，表达上调，受 ABA, NaCl, H2O2, cold 的诱导，表达下调。(4) 将已获得的目的基因 BdWRKYs 构建到 pCAMBIA1304 表达载体上，获得pCAMBIA1304-BdWRKY 植物过表达载体。(5) 基因枪介导的洋葱表皮细胞的瞬时表达分析显示，转录因子 BdWRKY2， BdWRKY7 和 BdWRKY43 均定位于细胞核。(6) 利用叶盘法转化烟草，成功获得了 13 株转 BdWRKY2、8 株转 BdWRKY7 和 12 株转 BdWRKY43 基因的烟草株系。同时，利用半定量 RT-PCR 技术进一步分析了 部分 BdWRKY2/7/43 基因过表达烟草株系的转录水平。(7) 分析了不同转 BdWRKY7 基因株系后代在干旱胁迫下的表型，发现过表达BdWRKY7 基因降低了转基因烟草对干旱胁迫的耐受性。本研究成功克隆了 BdWRKY2/7/43 基因，并转化了烟草，进而分析了部分转基因 株系外源基因的转录水平；另外，还分析了 BdWRKY2/7/43 基因在非生物胁迫及信号 分子处理下的表达模式，并分析了不同转 BdWRKY7 基因株系后代在干旱胁迫下的表 型，为后续 WRKY 基因响应非生物逆境胁迫的功能阐明乃至抗性农作物新品种的培 育奠定基础。关键词：二穗短柄草，WRKY，非生物胁迫，表达分析，亚细胞定位分析AbstractAbiotic stresses can seriously damage the growth and development of crops (such as wheat, barley, oats and so on), and severely r