二穗短柄草抗逆相关基因bdwrky36和bdmkk6.2的克隆及功能分析-cloning and functional analysis of stress tolerance related genes bdwrky 36 and bdm kk 6.2 in brachypodium monnieri.docx

A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Biochemistry and Molecular Biology Cloning and functional characterization of stress-related genes BdWRKY36 and BdMKK6.2 in response to abiotic stresses Ph.D Candidate ：Sun Jiutong Major ：Biochemistry and Molecular Biology Supervisors ：Prof. He Guangyuan Prof. Yang Guangxiao Huazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China February, 2015 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本论文属于 保密□，在 年解密后适用本授权书。 不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I I 摘 要 各种非生物逆境胁迫包括干旱、高盐、极端温度等严重影响植物的正常生长和 发育，其中对农作物产量和品质的影响尤为突出。因此，非生物胁迫相关基因的克 隆与功能解析，对深入阐明植物响应逆境的分子机理以及对农作物抗逆特性的遗传 改良具有十分重要的意义。 本研究以模式生物二穗短柄草和烟草为材料，研究内容分为两部分。其一，从 二穗短柄草中成功克隆了 17 个转录因子 WRKY 基因，并利用半定量 RT-PCR 技术 检测了其中 8 个 WRKY 基因在非生物逆境胁迫及信号分子处理下的表达水平以及 BdWRKY36、BdWRKY45、BdWRKY47 和 BdWRKY67 等 4 个转录因子蛋白的亚细 胞定位及转录激活活性；进而分析了 BdWRKY36 转录因子在干旱逆境胁迫下的功能 特性。其二，在实验室前期工作的基础上，克隆并研究了二穗短柄草蛋白激酶 BdMKK6.2 在干旱胁迫下的生物学功能。研究内容和主要研究结果如下： 1 ）通过检索 WRKY 基因数据库 HYPERLINK /WRKY/BrachyWRKY/ /WRKY/BrachyWRKY/ BrachyWRKYIndex.html，获得二穗短柄草 BdWRKYs 基因序列，将 BdWRKYs 序列 与植物基因组数据库 Eensembl Plants（ HYPERLINK /index.html /index.html）中的二穗 短柄草基因组进行比对分析，并以 BdWRKYs 序列和比对到的序列为基础设计特异引 物，利用 RT-PCR 技术，克隆得到 17 个 WRKY 基因的 cDNA 序列。经过生物信息 学分析，发现这些基因涵盖了 WRKY 转录因子的三种类型。其中，BdWRKY27、 BdWRKY45、BdWRKY46、BdWRKY46、BdWRKY67 蛋白属于 I 类，BdWRKY39、 BdWRKY4、BdWRKY21、BdWRKY36 属于 II 类，BdWRKY10、BdWRKY17、 BdWRKY19、BdWRKY20、BdWRKY22、BdWRKY40、BdWRKY78、BdWRKY79 属于 III 类。 2）通过半定量 RT-PCR 技术检测了 8 个 BdWRKYs 基因在二穗短柄草不同器官 的表达模式以及在干旱、高盐、极端温度等非生物逆境胁迫以及信号分子 ABA 和 H2O2 处理下的表达变化。发现不同的基因在不同器官中的表达量有较大的差异，大 部分基因（BdWRKY21、BdWRKY36、BdWRKY40、BdWRKY45、