番茄景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶基因的克隆及遗传转化-cloning and genetic transformation of sedum tomato heptyl ketose - 1,7 - diphosphate esterase gene.docxVIP

山东农业大学博士学位论文 山东农业大学博士学位论文 番茄景天庚酮糖-1, 番茄景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酯酶基因的克隆及遗传转化 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中文摘要 番茄（Lycopersicon esculentum）是我国主要的设施蔬菜，属于冷敏感和喜光植 物。景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶（SBPase）位于 Calvin 循环的再生和同化阶段的分支点 上，对维持 Calvin 循环中 RuBP 的再生以及碳源的流通具有十分重要的作用。尽管 SBPase 在植物体内含量很低，却是限制 RuBP 再生速率的关键酶。通过基因工程的手 段提高光合酶的含量和活性，对改良作物的光合能力具有重要意义。 本研究以番茄为试材，克隆 SBPase 基因，分析其在番茄中的内源表达特性和昼夜 变化模式；构建正、反义表达载体，通过农杆菌介导转化番茄，获得了转基因植株， 分析了 SBPase 对番茄生长发育及光合作用的影响及其影响机理。研究结果如下： 1. 利用同源序列设计简并引物，通过 RT-PCR 的方法从番茄叶片克隆到 SBPase 基 因的中间片段，通过 5’-RACE 和 3’-RACE 分别克隆到 5’ 和 3’ 片段，拼接后设计特异 引物扩增到全长 cDNA，命名为 LeSBP（FJ959073）。该基因全长为 1564 bp，ORF 为 1185 bp，编码 394 个氨基酸，分子量约为 42.5 kDa。 2. 同源序列比较发现，番茄的 SBPase 氨基酸序列与黄瓜、桑树、拟南芥、菠菜、 小麦、水稻和衣藻的同源性分别为 83.80 %、85.03 %、80.05 %、80.71 %、76.65 %、 78.45 % 和 61.31 %。在 SBPase 氨基酸序列中，有 6 个 Cys（cysteine）是保守的，其中 的 2 个 Cys 形成的 CGGT(A/Q)C 结构，是参与光调节反应的氧化还原活性位点。 3. 构建了原核表达载体 pET-LeSBP，并在大肠杆菌 BL21(DE3)plysS 中诱导表达。 以诱导蛋白免疫小白鼠，制备抗血清。测得效价为 1:500，可以用于番茄中 SBPase 蛋 白的免疫分析。 4. Real-time PCR 和 Western 杂交结果显示，SBPase 在番茄叶、茎和绿色果实中均 有表达，以叶片中表达量最高，明显高于其他组织，在不含叶绿体的根中没有检测到 该基因的存在；在不同叶位叶片中以中部功能叶（第 8 片展开叶）表达量最高，上位 叶和下位叶表达量较低；第 8 片展开叶的 Pn 明显高于第 1, 4, 12 和 16 片展开叶，不同 叶位叶片的 Pn 与 SBPase 基因表达量及活性的变化趋势一致；番茄功能叶片（第 8 片 展开叶）的 Pn 和 SBPase 活性及其 mRNA 相对表达量呈现相同的日变化趋势，说明 SBPase 对番茄的光合作用具有重要的调控作用。 5. 将获得的 LeSBP 与含有 35S 启动子的 pBI121 载体重组，分别构建了正义和反义 表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，用 Real-time PCR 和 Western 杂交方法 对具有卡那抗性的转基因番茄植株检测，结果显示，转正义基因植株中 LeSBP 在转录 水平和蛋白水平过量表达，反义植株中基因发生沉默。 6. LeSBP 过量表达时，转正义番茄植株的 SBPase 活性与 Pn 明显提高，碳水化合 物积累量增多，茎加粗，叶面积变大，干物重量及根/冠比增加，初花期比野生型提早 5~7 d；反义抑制 LeSBP 表达时，SBPase 活性下降，Pn 降低，茎变细，叶面积变小， 生长缓慢，初花期延迟 2~5 d。 7. 低温胁迫 2 h，番茄叶片的 LeSBP 表达量及 SBPase 活性显著降低，Pn 明显减 小，Fv/Fm 和 фPSII 变化不大。转正义番茄植株的 Pn 下降幅度和电解质渗漏率增加幅 度明显小于野生型，Fv/Fm 和 фPSII 与野生型差异不显著；而反义介导的 LeSBP 的缺 失导致转反义番茄植株的 Pn 下降幅度和电解质渗漏率增加幅度明显大于野生型。可见 LeSBP 过量表达可减轻低温对番茄光合作用的影响，提高番茄的耐冷性。 关键词：番茄；景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶；克隆；基因表达；遗传转化；光合速率 Abstract Tomato (Lycopersicon esculentum) is an important cold-sensitive vegetable cultivated in solar-greenhouse. Sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase is a key enzy