第五章 目的基因的分离与修饰.ppt

染色体体步移法(chromosome walking) (1)方法： 在人类和其它动物的定位克隆可用染色体体步移法：用邻近的标记为探针，在基因组文库中筛选重叠克隆。直到目的基因被克隆出。 (2)步移的方向和进度可通过中期染色体原位分子杂交来确定。 (3)大范围染色体步移有困难，因存在重复顺序而不能进行分子杂交。 (4)此可通过染色体跳跃(chromosome jumping) 来克服。 基因定位候选法克隆目的基因 原理：利用染色体的表达图谱，直接寻找与某一功能密切相关的目的基因。 步骤： 1)将疾病相关基因定位于染色体的精细区段 2)通过数据库查找已定位该区段的各候选基因表达图谱。 3)通过对基因编码的蛋白质进行功能分析，找出最可能的候选基因。 4)对候选基因进行突变分析，确定目的基因。 水稻抗白叶枯病基因Xa26 MDJ8/MH63 1 2 3 4 5 Rb17 MH63 MDJ8 IR24 IRBB3 1 2 3 4 Rb18 编码LRR受体激酶 粳稻背景能更好发挥Xa3/Xa26基因的功能 超量表达Xa3/Xa26可进一步增强水稻的抗性、扩大抗谱 RM224 aA13 aP16 aP4 M44-28 R1506 M196-1 3/7A-10 Y6855RA 42A4 76P14 43K22 3H8 31B6 3/7A-80 2 2 2 0 0 14 14 14 0 About 300 kb Xa26 Sun et al. 2004 Plant J. 四、 标签法 Gene Tagging 突变体库就是由某种方法产生的、包含各种不同基因突变的群体。饱和突变体库是指理论上该基因组的每个基因都发生了突变的突变体库。 利用Ｔ-ＤＮＡ插入突变,在拟南芥 (Ａｒａｂｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)中已经建立了接近饱和的插入突变体库,该突变体库包含超过225000个独立的Ｔ-ＤＮＡ插入株系,在预测的29454个基因中有21700个基因发生了插入突变。 水稻大型突变体库数据库的建立 数据库网址为： 数据库信息包括 突变体的编号 突变表型（图片） 报告基因的表达（图片） 突变体的T-DNA拷贝数 侧翼序列 种子有无、供种信息 实行动态管理 数据库已在Nucleic Acids Research公布 Expression patterns detected in the enhancer trap lines 五、从文库中筛选分离目的基因 筛选DNA文库是分离目的基因常用的方法； 在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且 大多数基因的产物不具有可选择的表型特征， 因此可采用以下策略来进行筛选： 基因文库的筛选 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选． 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选． 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选． PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段． 一）.表型筛选法 根据功能筛选文库 二）.分子杂交法 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法 探针的标记 核酸分子杂交的基本原理 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 质粒载体构建cDNA文库 第三节 目的基因的分离与制备 ＤＮＡ 结构、位置 ｍＲＮＡ 差异表达、结构 蛋白 差异表达、结构、功能 生物信息、合成、扩增、、、 一、根据蛋白质的性质分离目的基因 1) 根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因 对于未知功能的蛋白质基因，其目的基因的分离可从蛋白质开始，通过蛋白质的分离纯化、蛋白质氨基酸序列的测定、相对应的基因片断序列的设计