IEF使用过程中常见问题及解决方法.docVIP

IEF使用过程中常见问题及解决方法 以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。 如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。 问题 可能原因 解决方法 初始电流低或为零 ? IPG胶条与电极接触不好. ?检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上. ? PROTEAN IEF等电聚焦仪与聚焦盘电极接触不完全. ?检查聚焦盘的放置位置，确保PROTEAN IEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触. ? IPG胶条水化不完全 ?确保IPG胶条完全并平均地进行水化。检查水化液体积及水化时间. 在升压过程中电压不上升. ? 盐浓度过高 ?检查盐浓度并对样品进行除盐处理. 电压未能达到预设电压或达到极限电压过程非常缓慢 ? Bio-Lyte浓度过高 ? 将Bio-Lyte 浓度降至 0.2% (v/v). ? 对不同尺寸的IPG 胶条和pH梯度电压设置过高. ? 在聚焦时请用伏小时进行编程，以确保样品的完全聚焦. ? 过多的样品在水化过程中未能进入胶条, 或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨 ? 如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条, 或在聚焦前除去多余的样品液. 电压及电流波动很大. (同时电阻错误信息会显示) ? IPG胶条中有水化较差的区域, 或IPG 胶条在运行过程中已经烧干. ? 检查水化缓冲液体积及时间. 确保在水化期间水化缓冲液平均地分配. ? 限流过高. ?建议限流50μA/胶条. 确保输入正确的IPG胶条数目. 问题 可能原因 解决方法 烧胶条 (这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示.) ? 限流过高. ? 建议限流50μA/胶条. 确保输入正确的IPG胶条数目. ? IPG 胶条已经烧干. ? 确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干 ? 电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液. ? 确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态. ? 水化缓冲液成份不合适, 盐浓度过高. ? 检查水化缓冲液浓度。必要时重新配制缓冲液.  双向电泳实验中常见问题 水平条纹 出现的问题: 胶上出现连续性横纹。 可能的原因: 蛋白质没有完全和稳定溶解。 推荐解决的方法: 用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e.g.CHAPS, ASB-14），两性电解质和还原剂（DTT or TBP）非常重要。每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液： 8–9 M urea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 样品须有充分的溶解时间和变性时间。通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。 进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（10,000 rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。 推荐产品: ReadyPrep protein extraction kit (total protein/全蛋白) 出现的问题: 出现不连续的横纹。 可能的原因: 样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA, RNA),脂类,多糖和酚类化合物。 推荐解决的方法: 以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud （1996）.盐：为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理 （Damerval et al. 1986）,也可选用ReadyPrep 2-D cleanup kit。沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂：SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。如果在样品制备