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PCR聚合酶链式反应PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反应体系与反应条件 　　标准的PCR反应体系： 　　10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 　　模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul 　　PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)标准的PCR过程分为三步： 　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 　　2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。 　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。PCR 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 阈值：在荧光的增长曲线上人为地设定一个值。 标准偏差： (Std Dev) -统计学名词。一种量度数据分布的分散程度之标准，用以衡量数据值偏离算术平均值的程度。标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差的大小可通过标准偏差与平均值的倍率关系来衡量。标准偏差公式：本底值是指没有进样时检测器的信号值.本底值大小和检测器类型有关。?threshold）：?以PCR反应的前15?个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15个循环的荧光信号的标准偏差的10?倍。 Ct值：值得是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增是的循环周期数。计算方式是以扩增过程前的3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（ct）.Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。 绝对定量：是使用一系列稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标准品的ct值与骑士模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系，绘制标准曲线。可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度。 相对定量：在相对定量中，标本中特定mRNA的测定时建立在外标或参比样本（校准品）的基础上的。当使用校准品的时候，定量测定结果可表示靶RNA/校准品比值。 保准品（standard）：用来构建标准曲线的已知浓度的样本。 Taqman探针是RNA探针。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。FAM是常用的荧光基团，连接在Taqman探针的5’末端从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。与