生物化学核酸性质及研究方法-2010.ppt

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。 核酸的离心分离纯化 ◆ 紫外分光光度法(A260) ◆ 定磷法（DNA含磷9.2%，RNA含磷9.0% ） ◆ 定糖法（DNA；二苯胺法， RNA；苔黑酚法） 核酸的定量 核酸的纯度 ★ 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 三 DNA一级结构的测定 末端终止法 化学断裂法 焦磷酸测序 前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离，分离以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术，该项技术无需电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。 (一) 末端终止法 又称双脱氧终止法 英国 Sanger 1955确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5′-端向3′-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3′-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3′,5′-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。 图13-10 末端终止法测定DNA一级结构的原理和步骤 末端终止法 进行四组平行反应 每一组反应混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP，有一种被32P标记 每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。 在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。 有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。 每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。 对每一组反应混合物走凝胶电泳。 片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。 从凝胶的底部向上读出序列。 将读出的序列转化成互补链的序列。 （二） 化学断裂法 Maxam-Gilbert ， 1977 原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸 的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影 得到测序图谱。 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG 化学断裂法 进行四组平行的反应： G特异性剪切 ——在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（ DMS ）处理，然后再使用哌啶处理。 嘌呤碱基特异性剪切——DNA先进行酸处理，然后再加DMS。 嘧啶碱基特异性剪切——先用肼处理，然后用哌啶处理。 C特异性剪切——在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。 即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、A＋G、C＋T和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列。 (三) 焦磷酸测序 焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链的3′-端并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。 DNA自动分析仪的组成 四 RNA一级结构的测定 目前用来测定RNA一级结构的方法主要有： （1）先使用逆转录酶将待测RNA逆转录成cDNA，然后再 使用Sanger的末端终止法进行测定； （2）用化学或/和酶学方法对放射性同位素标记的RNA进 行部分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析； （3）质谱法 一 核酸与遗传信息的传递和表达  （一） DNA是基本遗传物质 1944 ， O. Avery 肺炎双球菌转化实验 1952 ， A.D Hershey 和M. C