微生物学课件第二节 细菌基因转移的方式宣讲培训.pptVIP

接合 (conjugation)： 细胞与细胞的直接接触（由F因子介导） 转导(transduction)： 由噬菌体介导 自然遗传转化(natural genetic transformation)： 游离DNA分子 + 感受态细胞 第三节 基因克隆及重组DNA技术 利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或 DNA序列插入一个载体DNA分子上，导入宿主 细胞内，使其扩增和表达。 基因克隆 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或 合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内， 使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生 物表现出新的性状。 基因工程（genetic engineering）或 重组DNA技术(recombinant DNA technology) 二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了 生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。 微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着 不可替代的作用！ “微生物与基因工程” 一、基因工程的基本过程 1. 基因分离： a）分别提取供体DNA和载体DNA 2. 体外重组 b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA 在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和 载体连接，成为重组载体。 3. 重组载体的传递与筛选 用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定 的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子. 4. 在特定的宿主中表达,得到基因工程产品 大肠杆菌生产胰岛素 假单胞菌生产毒素蛋白 二、基因工程的发展历史 对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术： DNA的特异切割 DNA的分子克隆（人工转化方法的建立） DNA的快速测序 聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增） DNA合成技术 DNA的定点诱变技术 基因工程工具酶 基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物 中分离和纯化而获得的 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。 在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的 限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA， 同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。 限制性内切酶 I型：单一多功能(限制-修饰)的酶，不是特异性的切割，所以用处不大。III型：双功能的酶，特异性的切割，用处不大。 II型：分开的核酸内切酶和甲基化酶 (EcoRI, MEcoRI)。特异性的切割，十分有用。识别序列通常由4-8个碱基对组成，具有回文结构。 EcoRI: Escherichia coli RY13, 识别序列:GAATTC CTTAAG BamHI: Bacillus amyloliquefaciens H, 识别序列:GGATCC CCTAGG 限制性内切酶的剪切方式 常用限制性内切酶 酶连 DNA连接酶(1967,许多实验室同时发现)的发现和应用对于重组DNA技术的创立和发展也具有头等重要的意义。将两段DNA拼接起来的酶叫连接酶，目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段： 第一种：粘性末端连接； 第二种：平端连接； 第三种：先在DNA末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，再进行连接。 T4噬菌体DNA连接酶：它催化DNA 的5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键（Weiss等，1968） 转化 重组质粒DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 感受态细胞的转化 电穿孔转化 抗生素筛选 能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH 末端,催化核苷酸的聚合作用,而不发生从引物模板上解离的情况. 常见的DNA聚合酶：最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶是 大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）（DNA聚合酶；5’-3’外切核酸酶；3’-5’外切核酸酶）; 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，（没有5’-3’外切核酸酶的活性）； Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus;1976;Chien),能耐高温； pfu DNA聚合酶(Pyrococcu