植物细胞培养制药 知识讲稿.ppt

固定化反应器 特点： 较容易地控制培养系统的理化环境，可以研究特定的代谢途径，便于调节。 细胞位置的固定使其所处环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生产物合成。 可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因初级代谢产物积累造成对代谢的反馈抑制，延长生产周期，进行连续生产。 固定化反应器 种类： 主要有流化床、膜反应器和填充反应器 植物细胞固定化一般采取凝胶包埋、膜固定、网格和泡沫固定和表面吸附等。 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等 附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。 Alfermann等(1983)用气升式系统，采用海藻钙固定细胞成功地用30 L和200 L的反应器生产地高辛。 Jose等(1983)进一步用中空纤维反应器培养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质 Mavituna等（1987）使用板式反应器和循环床反应器培养固定化辣椒细胞，最大辣椒素生产速率（以干辣椒细胞计）达到0.5mg／g／d，与成熟期辣椒合成辣椒素的速率相当。 规模化培养中有关工程技术问题 悬浮培养系统必须适应植物细胞特性 细胞体积大。其平均直径比细菌大几十倍 通常以2～200个细胞，直径2mm大小的非均匀小细胞团形式存在。 抗剪切能力弱。 生长速度慢，周期长，培养基成分复杂，有利于微生物生长，因此在培养中维持无菌环境难度较大但又十分重要。 规模化培养中有关工程技术问题 培养液的流变特性－－粘度变化 是由细胞密度和细胞状态变化造成的 烟草细胞培养，当细胞密度低于7g/L时，培养液粘度基本不变，而高于此值时，培养液粘度增加。 长春花细胞培养密度在10g/L时，培养液粘度有赖于细胞年龄、形态和细胞团大小。 在相同物质浓度下, 大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团的表观粘度。 规模化培养中有关工程技术问题 氧气含量调节 KLa（氧的传递系数， Nv=Kla(C*-C) ）： 如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，KLa在20h-1左右时。细胞生长与次生产物合成维持在良好状态； 在15L通风式反应器中培养的烟草细胞，当KLa在5~10h-1的范围内，生物量和代谢产物随KLa增加而增加。 溶氧浓度：毛地黄细胞培养，当培养基氧浓度从10％饱和度上升至30％，细胞生长速率从0.15d-1上升至0.20d-1，如果继续上升至 40％，细胞生长速率反而下降至0.17d-1。 规模化培养中有关工程技术问题 CO2调节 在通气过程中，混入2％～4％的CO2能消除高通气速率对长春花细胞生长和次生代谢产物合成的不利影响。 规模化培养中有关工程技术问题 泡沫和表面黏附性 植物细胞培养中易产生泡沫，且覆盖蛋白质和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，形成非均相培养而影响培养系统的稳定性和生产率。 消除方法 化学消泡：天然油脂、高级醇类、聚醚类 机械消泡 提高植物细胞药物产量的途径 选择适宜的起始材料－－种类、部位 栀子（Gardenia jasminoides）胚轴 银杏 子叶 当归 根 红豆杉 幼嫩的茎 茜草 叶柄 高产细胞株的筛选 直接筛选法 红豆杉 紫杉醇 玫瑰茄 花色苷（比对照提高14.5倍） 诱变育种法 伊贝母－紫外光 黄连 －60Coγ （小檗碱含量达6.12%） 红豆杉 苯丙氨酸 高产细胞株选择 梅兴国（2001）通过在培养基中添加1.6mM的L-Phe，筛选出了抗Phe的红豆杉细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞3～5倍。 产生等于或高于亲本植物药物含量的植物细胞培养系统 植物种类 ? 培养类型 化合物 含量（％）干重 ? 化合物 植物 人参 愈伤 人参糖苷 27 4.1 海巴戟 悬浮 蒽醌 18 2.2 洋紫苏 悬浮 迷迭香酸 16 3.0 紫草 悬浮 紫草宁 14 1-2 唐松草 悬浮 小檗碱 10 0.01 日本黄连 悬浮 小檗碱 10 2-4 蓬子菜 悬浮 蒽醌 5.4 1.2 猪殃殃 悬浮 蒽醌 3.8 0.2 烟草 愈伤 烟碱 3.4 2.0 优化培养基 选择合适培养基种类及植物生长调节剂 桅子 －－藏红花酸－－心脏病 B5，MG-5利于细胞生长 M-9利于黄色素合成 （钟青平等1994） 高山红景天－－红景天苷－－抗疲劳、抗缺氧 NAA; BA好于2,4-D; IAA; KT（韩爱明等1997） 胡萝卜－－黄酮 GA3 抑制（Hindere et al.1984） 桔叶鸡眼藤 －－蒽醌 1mg/L NAA促； 1mg/L 2,4-D抑 （Linus等1995） 烟草 －－尼古丁 IAA促；2,4-D抑（Furuya1987） 不同植物激素对长春花细胞的悬浮培养物中生物碱