第五篇 章 血清学反应 免疫学课件.pptVIP

衬板 样品垫 金标垫 吸收垫 膜 胶体金免疫层析试纸条的构成 对照线 检测线 胶体金免疫层析试纸条类型： 夹心法反应原理 C 阴性 B 阳性 GICA有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法。 间接法反应原理 C 阴性 B 阳性 阴性 弱阳性 阳性 竞争抑制法反应原理 检测线颜色强度与SD浓度负相关 结果判定（例） 1、禽流感H9亚型抗原检测试纸卡：两条红线，阳 性；一条红线，阴性；无红线，试纸失效。 2、禽流感抗体检测试纸卡：两条红线，阳性；一 条红线，阴性；无红线，试纸失效。 3、磺胺嘧啶残留检测试纸卡：两条红线，阴性； 一条红线，阳性；无红线，试纸失效。 抗体金标检测结果 左:阳性 右:阴性  第四节 补体结合试验 补体结合试验 （一）用途： 1）传染病诊断，病原性抗原及相应抗体的检测； 2）其他抗原的检测，如肿瘤相关抗原、血液中的蛋白质鉴定，HLA分型等； （二）补体结合试验原理及步骤 待检系统 指示系统 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　 电泳分析 ＋ 沉淀反应 抗原抗体反应 的高度特异性 电泳技术的高 分辨率、快速、 微量 免疫电泳技术 原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍 技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～1h。 （一）、对流免疫电泳 通电 － 蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动 抗体球蛋白 带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动 ＋ 对流免疫电泳 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。 对流免疫电泳 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 原理 免疫扩散＋电泳,定量检测技术 （二）、火箭免疫电泳 1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。 技术要点 火箭免疫电泳 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。 影响因素 火箭免疫电泳 　　　　火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本 - + 火箭免疫电泳示意图  第三节 免疫标记技术 免疫标记技术原理 原理：抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。将荧光素、酶分子、胶体金、放射性同位素等标记在抗体分子上，可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，此种根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术。 标记免疫技术一般分为两类： 　　（1）免疫组化技术(immunohistochemicaltechnique)：用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。 　　（2）免疫测定(immunoassay)：用于液体标本中Ag或Ab的测定。 免疫标记技术的分类 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为： 免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 发光免疫测定。 基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性同显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。 然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。 一、免疫荧光技术 荧光显微镜 1、直接法 用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合；本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少。 2、间接法 滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体己发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。 此法的优点是敏感性高于直接法，而且只需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。 间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒 免疫