pi3kakt在wnt5a诱导的人骨肉瘤细胞迁移中作用机制的研究-study on the mechanism of pi 3 kakt in wnt5a - induced human osteosarcoma cell migration.docxVIP

Herbert螺钉治疗锁骨骨折的三维有限元分析及临床应用研究英文摘要toPI3K/Aktincellmotility.ThisresultwillcontributetofurtherunderstandingofbiologicalrolesofWnt5a/PI3K/Aktincellmigrationofosteosarcomaandothercancers.Keywords:Wnt5a，osteosarcoma，migration，PI3K，AktWrittenby:Xin-yuHuSupervisedby:Liang-huaDing目录前言1PI3K/Akt在Wnt5a诱导的人骨肉瘤细胞迁移中作用机制的研究2材料与方法2结果9讨论13结论14参考文献15综述17参考文献29中英文缩写对照表38攻读学位期间公开发表论文40致谢41PI3K/Akt在Wnt5a诱导的人骨肉瘤细胞迁移中作用机制的研究前言前言成骨肉瘤是常见于儿童和青少年的病死率很高的恶性肿瘤。既往成骨肉瘤仅限于手术治疗，5年生存率仅为20%左右[1]。近年来，新辅助化疗的出现使患者的5年生存率大为提高，保肢手术逐渐取代截肢手术。尽管治疗效果有所提高，但现有对成骨肉瘤侵袭及转移的早期预诊手段不能令人满意。成骨肉瘤细胞的转移和其他恶性肿瘤细胞的转移类似，是个多步骤的过程。恶性肿瘤细胞经过浸润、侵入血管、渗出血管和在转移部位开始生长等步骤，进而完成转移的全过程，其中任何一个环节的缺失都会导致恶性肿瘤细胞转移的失败[2]。现有的研究表明，上述步骤的完成有赖于恶性肿瘤细胞细胞骨架结构和功能、粘附功能和运动能力等的改变。虽然，已有的研究使人们对于上述改变在恶性肿瘤细胞转移中的作用有了进一步的了解[3]，然而由于恶性肿瘤细胞转移机制十分复杂，因此，为了对恶性肿瘤细胞转移的分子机制有一个完整的了解，更多更深入的研究显得十分迫切。既往的研究发现，成骨肉瘤的转移和CXCR4、VEGF等趋化因子相关。而且，Wnt信号通路参与多种恶性肿瘤的发生和转移过程。其非经典通路Wnt5a通路在不同恶性肿瘤的发生和发展过程所起的作用不一致，可见其调控机理极其复杂。而且，目前为止Wnt5a在成骨肉瘤的发生和发展中是起抑制还是促进肿瘤发生和发展的作用尚无定论。本研究中我们想知道Wnt5a是否能诱导骨肉瘤细胞的迁移，并探讨PI3K/Akt信号通路是否参与到这个过程。PI3K/Akt在Wnt5a诱导的人骨肉瘤细胞迁移中作用机制的研究PI3K/Akt在Wnt5a诱导的人骨肉瘤细胞迁移中作用机制的研究材料与方法一、材料1试剂青霉素和链霉素、丙烯酰胺、SDS、Tris、TEMED、DTT、甘氨酸和琼脂（美国Amresco公司）；胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培养基（美国Gibco公司）；二甲亚砜（DMSO）、水溶性封片剂、牛血清白蛋白（BSA）、TritonX100（美国Sigma公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（南通碧云天生物技术研究所）；蛋白标准品（上海西巴斯生物技术开发有限公司）；SDS蛋白质分子量标准（美国Fermentas公司）；硝酸纤维素膜（美国MSI公司）；ECL化学发光底物（美国Pierce公司）；抗体（美国CellSigalingTechnology公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记鼠二抗和兔二抗（美国SantaCruz公司）；其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂公司。2耗材和仪器细胞培养板和细胞培养瓶（美国Costar公司）；高速低温离心机、紫外分光光度计（德国Eppendorf公司）；酶标仪（Elx800，美国Bio-Tek公司）；电泳仪、半干式转膜仪、凝胶成像及分析系统和MastercyclerPCR仪（美国Bio-Rad公司）；倒置显微镜（TMS，日本Nikon公司）；荧光显微镜（BX51型，日本Olympus公司）；净化工作台（苏州净化仪器厂）；CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）。二、方法1细胞培养1.1主要溶液的配制及剂量DMEM培养基DMEM培养基粉末一袋加去离子水至1000ml青霉素100U/mlPI3K/Akt在Wnt5a诱导的人骨肉瘤细胞迁移中作用机制的研究链霉素100μg/ml调节pH至7.6，过滤灭菌，4℃保存。临用前，加入10%新生牛血清（NBS）。胰蛋白酶0.25%胰蛋白酶（溶于1×PBS中）过滤灭菌，-20℃保存。磷酸缓冲液（PBS）NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.12H2O3.58gKH2PO40.27g加去离子水至1000ml，高压灭菌，4℃保存。1.2细胞传代培养细胞接种于60ml的细胞培养瓶中，用完全DMEM培养基进行培养。2-3天后待细胞长至致密单层时移去培养基，用PBS清洗细胞2次，加入37℃预热的0.25%胰蛋白酶消化1min左