血管内皮生长因子d在乳腺癌转移和侵袭中作用的实验分析-experimental analysis of vascular endothelial growth factor d in breast cancer metastasis and invasion.docx

血管内皮生长因子D在乳腺癌转移和侵袭中作用的实验研究中文摘要第一部分VEGF-D/VEGFR-3在人乳腺良、恶性病变中的表达1、目的：检测VEGF-D/VEGFR-3在乳腺良、恶性组织中的表达，并进行淋巴管计数。2、材料和方法：乳腺癌标本40例、良性病变80例，real-timeqPCR技术检测乳腺组织中VEGF-D/VEGFR-3mRNA水平的表达，免疫组化方法检测VEGF-D/VEGFR-3在蛋白水平的表达并计数D2-40标记的阳性染色淋巴管数量（LVD）。3、结果：以real-timeqPCR方法检测VEGF-DmRNA的表达，发现在乳腺癌组织、乳腺良性组织中存在明显差异，其在乳腺癌组织中表达量明显高于乳腺良性组织(P0.05)；VEGFR-3mRNA在乳腺癌组织中表达量明显高于乳腺良性组织，存在明显差异(P0.05)。用免疫组化方法检测VEGF-D/VEGFR-3蛋白水平的表达情况，结果显示二者在乳腺癌组织中均呈不同程度的高表达，阳性染色计数显著高于良性组织中，差异显著(P0.05)；同时计数了D2-40标记的阳性淋巴管密度（LVD），亦在恶性组织中有更高的表达。4、结论：real-timeqPCR技术和免疫组织化学技术用于乳腺组织中VEGF-D/VEGFR-3的检测是可行的。乳腺癌中VEGF-D/VEGFR-3的表达以及淋巴管密度（LVD）显著高于良性乳腺组织，在mRNA和蛋白水平的差异都有统计学意义。VEGF-D及其受体可能可以作为研究乳腺癌转移和侵袭能力的参考指标。I第二部分人乳腺癌中VECF-D/VEGFR-3表达的临床意义1、目的：结合乳腺癌临床病理特征分析VECF-D/VEGFR-3异常表达的临床意义和研究价值。2、材料和方法：选用同一批样本，收集每位患者的手术史、肿瘤大小、病理分级、分型、合并淋巴结转移情况、是否有远处转移和其他相关肿瘤指标包括，雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体-2(Her2)，采用统一的免疫组化染色评分标准，分析乳腺癌中VECF-D/VEGFR-3表达的临床意义。3、结果40例样本中，VEGF-D32例阳性表达，瘤内高表达28例（70%），而在肿瘤周边表达相对弱，高表达为9例（22.5%），标本不同部位的高表达的例数相比有统计学差异(P0.05)；VEGFR-3可见阳性细胞的有37例（92.5%），瘤内呈高表达者19例（47.5%），瘤周高表达者22例（55%），标本中不同部位高表达的例数没有显著区别(P0.05)；D2-40标记阳性例数为40例（100%），不论染色强弱，以阳性淋巴管密度（LVD）作为评价指标，瘤周显著高于肿瘤实质内(P0.05)。VEGF-D在瘤内的高表达与VEGFR-3密切相关，而瘤周的表达与VEGFR-3无关。VEGF-D的表达水平和乳癌患者淋巴结转移、肿瘤的病理分级、Her2的表达和LVD数值密切相关，，有统计学意义(P0.05)，与患者年龄、月经状态、肿瘤大小、ER、PR、一年期无进展无相关性(P0.05)。VEGFR-3的表达水平和患者淋巴转移密切相关（P0.05），和患者的其他临床因素没有显著相关性（P0.05）。LVD计数在瘤周显著高于瘤内（P0.05），与病理分级、淋巴结转移密切相关（P0.05），与其他因素无相关性（P0.05）。4、结论乳腺癌中VEGF-D和LVD的表达存在位置特异性，前者瘤内表达强，后者瘤周表达强于瘤内，并且与患者淋巴结转移、病理级别和Her2表达有关；VEGFR-3的表达与淋巴结转移相关，三者均是研究乳腺癌侵袭和转移的有价值的指标。II第三部分靶向VEGF-D的shRNA构建及其对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和侵袭的影响1、目的：构建靶向VEGF-D的shRNA，在细胞实验中验证其稳定性、转染效率和生物学功能。2、材料和方法：按照shRNA序列设计原则设计并合成3条针对VEGF-D基因的shRNA，挑选最有效抑制VEGF-D基因表达的一条干扰序列，转染乳腺癌细胞MDA-MB-231，Western-blot检测转染特异shRNA后乳腺癌细胞VEGF-D和VEGFR-3的蛋白表达情况，计数细胞存活比率，MTT法检测细胞增殖。3、结果：成功构建了正确的靶向VEGF-D的shRNA，其中一条干扰RNA降低VEGF-D的mRNA和蛋白表达的能力最强，命名为shRNA1，同时建立对照组。检测细胞计数发现干扰组和对照组没有显著差别（P0.05），MTT法检测细胞凋亡发现细胞生长未受明显影响（P0.05）；VEGFR-3蛋白的表达明显下降（P0.05），Transwell小室实验发现干扰组穿过人工基质的能力明显下降（P0.05）。4、结论：靶向VEGF-D的shRNA能显著降低VEGF-D和VEGFR-3的表达