血管性痴呆大鼠脑5-ht6受体表达变化与认知功能障碍的分析-changes of brain 5 - ht6 receptor expression and cognitive dysfunction in vascular dementia rats.docxVIP

广州医科 广州医科大学硕士学位论文 血管性痴呆大鼠脑 5-HT6 受体表达变化与认知功能障碍的研究 PAGE PAGE 3 2 Morris 水迷宫实验行为学观察 观察慢性脑缺血对大鼠学习、记忆的影响以及 5-HT6R 拮抗剂 SB-399885 对空 间学习、记忆障碍的干预作用 假手术组和 VaD 组在 BCCAo 术后 4 周和 8 周、VaD-Placebo 组和 VaD-SB399885 组在药物干预（4 周）结束后 24 小时分别进行 Morris 水迷宫实验，记录定位航行试 验中大鼠找到逃生平台的平均逃避潜伏期（Mean Escape Latency Time, MELT）和空 间探索试验中大鼠在目标象限的平均搜寻时间（Mean Time In Target Quadrant, MTiTQ）以此评估大鼠的空间学习、记忆能力。 3 慢性脑缺血后不同时间点大鼠海马、皮层的神经病理学观察 3.1 脑组织取材、石蜡包埋和制片 BCCAo 术后 2 天、1 周、4 周、8 周从假手术组和 VaD 组中分别各取 5 只大鼠， 麻醉后经心脏灌注固定，断头取脑，自视交叉后 3mm 处冠状位切取约 3mm 厚度脑 组织，梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋。 3.2 神经病理学染色 石蜡组织作冠状位连续切片（2μm），苏木素-伊红染色和尼氏染色后在光学显 微镜高倍镜（400×）下观察。 4 RT-PCR 分析脑组织 5-HT6R mRNA 表达水平 观察慢性脑缺血 5-HT6R mRNA 表达的动态变化及脑缺血后 5-HT6 受体拮抗剂 SB-399885 干预对 5-HT6R mRNA 表达水平的影响 提取各组大鼠脑组织总 RNA，将其逆转录成 cDNA 后，按 FastStart Universal SYBR Green ROX 试剂盒说明书建立 PCR 反应体系，检测各组脑组织中 5-HT6R mRNA 表达水平。 5 免疫组织化学检测大鼠海马 CA1 区、皮层神经元 5-HT6 受体表达 观察慢性脑缺血 后 5-HT6 受体表达的 动态变化 及选择性 5-HT6R 拮抗剂 SB-399885 对血管性痴呆大鼠海马 CA1 区、皮层神经元 5-HT6 受体表达的影响 石蜡切片经脱蜡、水化和高压修复后，以 EnVision 酶免疫组化法检测海马 CA1 区、皮层神经元 5-HT6 受体；冰冻切片作免疫荧光检测皮层 5-HT6 受体。 6 统计学分析 应用上海欣软信息科技公司开发的 SuperMaze 动物行为学视频分析系统采集 Morris 水迷宫中动物运动轨迹；应用 ImagePro Plus 图文分析系统采集组织病理、免 疫组化图片及进行免疫组化平均光密度分析。应用 SPSS 13.0 统计软件对实验数据 进行分析，采用 Kolmogorov-Smirnov 正态性检验和 Levene 方差齐性检验，符合正 态分布的资料以均数±标准差（χ±s）表示；Morris 水迷宫实验数据采用单因素重 复 测 量 的 方 差 分 析 ， 当 资 料 不 满 足 Mauchly’s 球 对 称 性 检 验 时 采 用 Greenhouse-Geisser 法校正自由度；其余正态分布资料方差齐性采用 ANOVA，方差 不齐采用 Welch 校正检验，多重比较方差齐性采用 LSD 检验，方差不齐采用 Dunnett’s T3 检验。所有统计学结果以 P0.05 为差异具有统计学意义。 结果 1 Morris 水迷宫行为学分析结果 1.1 VaD 大鼠与假手术组大鼠在定位航行试验中平均游泳速度无统计学差异 （P0.05），提示 BCCAo 诱导的血管性痴呆大鼠不存在明显运动功能障碍。 1.2 术后 4 周和 8 周，在定位航行试验中 VaD 大鼠平均逃避潜伏期（MELT） 较假手术组大鼠明显延长（P0.001），在空间探索试验中目标象限的平均搜寻时间 （MTiTQ）则较假手术组明显缩短（P0.001），提示 VaD 大鼠存在空间学习和记忆 障碍。 1.3 维持 4 周 的选择性 5-HT6R 拮 抗 剂 干 预 处 理 后 ， 在定位航行试验中 VaD-SB399885 组 MELT 随训练而逐渐缩短的变化趋势较 VaD-Placebo 组明显 （P0.01），其在空间探索试验 Probe 1、Probe 2 的 MTiTQ 较 VaD-Placebo 组延长 （P0.05），提示 5-HT6R 拮抗剂 SB-399885 干预处理能减轻 VaD 大鼠的空间学习和 记忆障碍。 2 海马 CA1 区、皮层组织病理学观察结果 在 BCCAo 术后 2 天、1 周、4 周和 8 周，血管性痴呆组大鼠皮层及海马 CA1 区