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酿酒葡萄种苗（条）热处理脱毒技术研究 2002if-第5 SINo.ovERsEAsGRAPEvINEamp;WINE营@嬉 酿酒葡萄种苗(务)熬处理膨专技术研究 鉴于繁殖材料带病毒是葡萄 卷叶病的主要传播途径,在防治 上,加强检疫措施和使用无病毒 苗木是防治卷叶病最有效的措施. 热处理和分生组织尖端人工培养, 至今对脱去卷叶病毒(GLRaV) 还是较好的方法.1959年Goheen 教授创造了芽接热处理方法并取 得了很好的热处理脱毒效果,他 选用了生长势强,耐高温的LN. 33做砧木,将待处理植株的芽嵌 接在盆栽砧木的茎部,接种后放 置8天,待接口愈合后放置于热处 理箱(Heatchamber)内,保持38 ℃恒温.根据不同病毒对高温的 明敏感程度的不同,处理时间有 长有短.为寻找简便可靠的脱毒 方法,近年来澳大利亚,加拿大, 法国等不少国家的科学家们正在 进行葡萄茎尖组织培养脱毒的研 究,已有关于茎尖培养对 GLRaV,Yellowspeckle,Fleck 有良好的脱毒效果的报道. 热处理和生长点培养相结合 是将二者各自的优势融为一体, 从而使脱毒效果更为理想.Galzy 和Gifford在1961年用热处理和 茎尖培养相结合的方法除去了扇 叶病毒(GFLV).本实验在研究 葡萄茎尖培养和快繁技术的基础 上,探索了热处理和生长点培养 相结合脱除植株体内病毒的效果, 顾沛雯,张军翔 (宁夏农学院农学系,永宁750105) 为葡萄脱毒技术提供一条重要途径. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1植物材料 供试材料来源于宁夏西夏王 葡萄有限公司酿酒葡萄品种园带 毒种条(苗). 1.1.2抗血清 葡萄卷叶伴随病毒 III(GLRaV—III)的CP抗血清和 HRP—IgG由中国科学院微生物 研究所蔡文启老师赠送. 1.1.3辣根过氧化物酶标羊抗兔 和邻苯二胺由西北农林科技大学 植保系吴云锋老师赠送. 1.1.4DG一250型酶联仪 宁夏林业研究所提供. 1.2方法 1-2.1微茎尖培养 取无菌苗在双目解剖镜下切 取0.3～0.5mm,0.8mm茎尖,在 筛选适宜的培养基上培养,形成 完整植株. 1.2.2热处理材料茎尖培养 春季将萌发的盆栽的带毒葡 萄苗放置于自制热处理箱中,保 持箱内相对湿度70%～80%.经 过恒温热处理(38℃)30天和变 温热处理(白天38℃,夜晚32 ℃),经过60天后切取新梢,剥取 1.0～1.5mm微茎尖在筛选好的培 养基上培养,形成完整植株. 1-2_3试管苗热处理 将生根试管苗放在LRH一 250一G型光照培养箱中,先预热 处理(32~C)7天,然后将温度升 至38℃,热处理20天,30天,40 天后,剥取1～1.5mm茎尖培养. 1.2.4组培苗的病毒检测 采用间接ELISA检测.参照 Lommel等的方法并加以改进.葡 萄样品加样本缓冲液(1:1w/V) 研磨,5000rpm离心7～8分钟,取 上清液待用.测定时用包被缓冲 液稀释成1/10浓度,加入酶联板, 4℃冰箱中过夜.GLRaV兔抗血 清的工作浓度为1:2000,辣根过 氧化物酶标羊抗免的工作浓度为 1:500.HRP的反应底物为0.04% 磷苯二胺和0.15%的过氧化氢配 在0.01M柠檬酸一磷酸(pH5.4) 缓冲液中.加入酶联板后,室温 避光放置10～20分钟,每~L)JH 50~L2MH,SO(D液)终止反应, 用酶联免疫检测仪DG一25o~,1定 OD490值,以待测样品与阴性对 照的OD490比值(P/N)≥2.0确 定为阳性反应. 2结果与分析 2.1茎尖大小与脱毒率的关系 由表1结果表明,当切取茎尖 长度为0.3～0.5mm时,小株存活 率为20.9%～54.9%,GLRaV的 脱毒率为83.3%～86.4%;当切取 瞳2002fr-第5 茎尖在O.8mm以上时,存活率为 68.6%～78.7%,GLRaV的脱毒率 仅为59.5%～70.8%,随着茎尖长 度的减小成活率降低而脱毒率升 高.同时还表明不同品种间葡萄 茎尖的存活率有较大的差异,培 养相同茎尖长度(O.3～O.5mm) 的茎尖时,琼瑶浆的存活率为 54.9%,而西拉和白玉霓 的存活率仅为20.9%:~128.2%,脱毒 效果品种间差异不甚明显(表1). 2.2热处理材料进行茎尖培养的 脱毒效果 表2结果表明,恒温热处理后 切取的茎尖接种64个,成活22个, 其中无GLRaV的茎尖21个,分 离培养成活率和脱毒率分别为 34.4%3195.5%.接种变温热处理 的茎尖为62个,成活29个,其中 无GLRaV的茎尖27个,分离培 养成活率和脱毒率分别为46.8% 和93.1%.此外变温热处理的成 活率比恒温热处理的成活率提高 了12.4%,而脱毒率相差不大.热 处