三基因工程常用受体细胞.pptVIP

* 分子遗传学背景清楚，枯草芽孢杆菌的全基因组已被测序 * 新的转化方法如碱金属离子转化法 构建多重蛋白酶缺陷型受体菌 * * Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源 基因的表达 * * pPICZαA质粒，其 信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有 Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利 * 寡糖基是以共价键与蛋白质的氮或氧原子结合的，分别称为N-糖基化和O-糖 基化（glycosylation）。 * 是目前使用最为普遍和成熟的哺乳动物细胞。 应用 1981年酿酒酵母表达了 第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。 FDA批准的第一个基因工程疫苗就是酿酒酵母表达的乙肝疫苗（Merck公司） 上市产品还有人胰岛素（丹麦Novo－ Nordisk公司）和人粒细胞集落刺激因子（Immunex公司）等 第31页/共57页 存在问题 1、外源基因表达水平不高。 原因： （1）密码子使用的偏向性（tRNA与外源基因密码子不匹配） （2）乙醇发酵途径活跃导致生物大分子合成普遍受到抑制 （3）质粒的不稳定性 2、重组异源蛋白超糖基化修饰 第32页/共57页 二、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 是近年来发 展最为迅速，应用最为广泛的酵母细胞。 是一种甲基营养菌，能在相对较为廉价的甲醇培养基中生长。 第33页/共57页 优点 除具有一般酵母所具有的特点 外，还有以下几个优点： 1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一 －乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量高（一般 500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到12g/l） 。 2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。 3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外。 第34页/共57页 缺点 发酵周期长，要添加甲醇 分子生物学基础不清楚，遗传改造难度大。 第35页/共57页 应用 生产重组真核药物蛋白： 近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。 药物蛋白已有20多种，见 李元《基因工程药物》P52表。如人IL－2、人血清白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破伤风毒素C片断、人巨细胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即将进入市 场。 第36页/共57页 常用毕氏酵母菌 KM71和GS115:都具有HIS4营养缺陷标记。 GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用 正常型； KM71菌株：AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型 共同特点:为组氨醇脱氢酶缺陷株，与带有his标记基因的表达质粒配合使用 第37页/共57页 三、乳酸克鲁维酵母 具有可稳定存在的附加体型质粒pKD1载体及高拷贝整合型质粒pMIRK1 外源基因表达水平比酿酒酵母高，如由重组乳酸克鲁维酵母合成的人IL－1β是重组酿酒酵母的80－100倍。 第38页/共57页 四、多型汉逊酵母表达系统 蛋白糖基化修饰作用接近哺乳动物细胞。 也是一种甲基营养菌。 第39页/共57页 举例：利用重组酵母生产乙肝疫苗 第一代乙肝疫苗：病毒携带者体内提取 存在问题： 1、来源有限 2、提取过程复杂 3、致病潜在危险 4、成本高 第40页/共57页 第二代乙肝疫苗－重组乙肝疫苗 第一阶段：大肠杆菌重组乙肝疫苗。20世纪70年代末尝试用大肠杆菌表达乙肝表面抗原HBsAg，但表达水平极低 第二阶段：酿酒酵母重组乙肝疫苗。起始于20世纪80年代初，将HBsHg（或s多肽）的编码序列置于ADH1（酿酒酵母的乙醇脱氢酶1基因）启动子或PGK（磷酸甘油酯激酶基因）启动子后面，表达出具有免疫活性的非糖基化HBsHg 。目前已作为乙肝疫苗商品化，商品名为Recombivax－B或Engerix－B。 第41页/共57页 第三阶段：巴斯德毕赤酵母重组乙肝疫苗 HBsAg基因稳定整合在巴斯德毕赤酵母染色体上 表达产物量比在酿酒酵母中高1倍，并且表达蛋白效价高出酿酒酵母数十倍。 第42页/共57页 第五节、常用哺乳动物表达细胞 能在培养基中无限生长的哺乳动物细胞系。 一般为与正常细胞生理特性基本接近、无平面接触抑制特性的肿瘤细胞系或异倍体连续细胞系 第43页/共57页 有限细胞系和无限细胞系 有限细胞系（finite cell lin