荧光法测定游离胆红素浓度.docVIP

荧光法测游离胆红素浓度 背景 在新生儿黄疸的发病中，通常采用血清总胆红素（Bt）的浓度来评估高胆红素血症。然而，游离胆红素（Bf）可以透过血脑屏障产生神经毒作用。而总胆红素并没有这样的作用。此外，过氧化物酶法也可以用于测定血浆游离胆红素的浓度，但是这种方法相对复杂，所以使用受到了限制.在这里，我们将采用一种新的方法来测定血浆中的游离胆红素—荧光法。 原理 用荧光分子acrylodan标记突变的脂肪酸结合蛋白（BL22P1B11）使其产生荧光效应。但这种荧光效应会被游离胆红素抑制而发生荧光淬灭。当另一种荧光物质罗丹明B与该标记产物BL22P1B11结合则会使其结构发生变化生成BL22P1B11-Rh。 结果 用胆红素的水溶液校准Bf探针使其产生相似的解离常数 Kd=16(1.5)nm/L。然后用它来计算在平衡状态下人血清白蛋白和补充胆红素的血浆样本中的游离胆红素浓度。它们的测定结果是一样的，且与过氧化物酶法所测的值相等。我们测定的新生儿黄疸游离胆红素浓度的CV（拟内变异数）大约为3%。 结论 BL22P1B11-Rh探针所得的游离胆红素浓度是用一分钟内就可得到结果的便携式Bf测定仪或荧光计测定的。胆红素是血红蛋白的代谢产物，它难溶于水，且在血浆中可大量的与白蛋白结合。而游离胆红素是胆红素的一部分，当它达到一定的浓度时，就可以透过血脑屏障产生相应的神经毒作用⑴。正常情况下，人体血清总胆红素通过体内代谢，不断地产生和排泄维持在一个较低的浓度。然而，大约6%的新生儿，胆红素的清除率小于生成率，导致胆红素在体内积累产生黄疸⑵。这对于大多数新生儿来说是不利的。因为这些积累的胆红素很难经过自身的调节而清除⑶⑷。当这些游离胆红素超过一定浓度就可以通过血脑屏障进入中枢神经系统导致听觉障碍，甚至引起核黄疸。 早期的光疗和透析疗法可以逆转胆红素介导的神经毒作用⑵⑸⑹。这些治疗以总胆红素的浓度为依据，并考虑妊娠年龄和风险因素⑺。然而，基础生化和临床数据推断，游离胆红素比总胆红素更容易产生神经毒作用⑴⑻⑼⑽。因此，游离胆红素对于诊断新生儿胆红素的神经毒作用比总胆红素更有意义⑾。 当前测量游离胆红素的唯一方法就是通过辣根过氧化物介导游离胆红素产生氧化作用⑿。过氧化物的检验可以在FDA（美国食品与药品管理局）认证的仪器上进行。但这种方法复杂且需要使用很多器械和大量标本⒀⒁。除此之外，它还需要用稀释液校准，所以不能大规模的应用于新生儿黄疸的筛查⒀⒁。 在此，我们提出这种新的方法：用荧光标记的脂肪酸结合蛋白，即：Bf探针，直接测定体内游离胆红素的平均浓度. 材料与方法 Bf探针 Bf探针来源于鼠小肠的一种脂肪酸结合蛋白rI-FABP。这种结合蛋白分子量小 ，只有15KD大，水溶性，容易结合长链的游离脂肪酸，并且存在于大多数细胞的胞质内⒂。它可以用来生成、纯化和表征Bf浓度。实际上它和之前提到的游离脂肪酸探针大体相似⒃，在补充资料里也有显现。（/content/vol58/issue5） 简明的说，r1-FABP结合口袋残基诱变产生突变体库，共轭环境敏感型荧光基团arcylodan，可以转变突变的r1-FABP为探针来筛查对FFAu的反应。在这些探针中，大约有10%没有有效的对FFAu做出反应，反而对未结合胆红素有反应。对胆红素比较敏感的r1-FABP变异体会产生更多的突变，形成BL22P1B11。氨基酸序列图如下图所示： 形成的BL22P1B11在大肠杆菌BL21的pET上表达，并经过亲和、阴离子交换色谱法等而纯化。纯化后的蛋白与arcylodan反应后的产物通过疏水作用及浆纱色谱法被进一步纯化。再加入一定量的荧光物质罗丹明B，使它与BL22P1B11的比值为2:1，就可以得到BL22P1B11-Rh。我们使用的这两种物质都是制成的冻干粉沫，它们都可以在FFA科学里找到。 胆红素 将一定量的胆红素溶解于10m/L NaOH溶液中，氦气避光保存形成胆红素原液，其浓度为35~47mg/dL ,吸收峰为440nm,吸收率为54958mol/(l×cm)(CV=3.8%),取近似值55×103mol/(l×cm）.从人体血清白蛋白中提取胆红素需要90min.提取后稀释成25μmol/L 做游离胆红素的滴定。方法是：在HEPES缓冲液中加入600~660μmol/l HSA 和35~47mg/dl 胆红素做成浓度为0.1~1.4的胆红素-HSA复合物（20mmol/l HEPES,pH 7.4, 140mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl, 1mmol/L Na2HPO4）。所有的混合溶液HSA浓度均为300 μmol/L 。