抑制前列腺癌细胞psca的表达可通过抑制pi3kakt信号通路逆转emt-inhibiting the expression of psca in prostate cancer cells can reverse emt by inhibiting pi 3 kakt signaling pathway.docxVIP

广州医科大学硕士学位论文性等特征的获得;在这一过程中，有时仅有细胞功能的改变而无形态学的变化。【12】EMT 是个动态的过程，不仅参与机体的胚胎发育、创伤愈合等过程，也参 与 肿 瘤 的 浸润 转 移。【 13 】 EMT 的发 生 涉及 复 杂 的 机制 ； 其中 E- 钙黏蛋白 （E-cadherin)是关键因素。E-cadherin 不仅能与β连环素、γ连环素结合，然 后与α连环素相连最终合成 E-cadherin-β连环素α连环素复合体，与肌动蛋白 相 连 用 以 维 持 细 胞 极 性 及 细 胞 间 的 黏 连 。 Cavallaro 【 14 】得出了 cadherin-switch 学说，即当上皮细胞向间质细胞转化时，可观察到钙粘素家族（Cadherin）中的 E-Cadherin 表达下调，上皮细胞间粘附作用减弱，上皮细胞 外形变为纺锤形纤维细胞形态，而波形蛋白(Vimentin)、骨桥蛋白等表达可上调， 进而使细胞极性丧失，细胞间粘附作用降低，细胞侵袭转移能力增强。在分子水 平，EMT 以 E-cadherin 表达的下调和波形蛋白（Vimentin)表达的上调为特征【15】。Wei Yan【16】发现在肝癌细胞中可通过 PI3K/AKT 信号通路诱导 EMT 的 发生。在 PC-3 前列腺癌细胞株中，Minyoung Lim【17】证实可通过 PI3K/AKT 信号通路激活 EMT 的发生。而 PC-3 及 PC-3M 细胞被报道高表达 PSCA【7】。目前 PSCA 的生物学功能仍不清楚，但已有研究表明 PSCA 的表达水平与前列腺癌的侵 袭和迁移是密切相关的。因此我们推测在高表达 PSCA 的前列腺癌细胞株 PC-3、 和 PC-3M 中，抑制 PSCA 的表达是否能够通过抑制 PI3K/AKT 信号通路，从而抑制 肿瘤细胞的 EMT，进而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。3材料与方法材料与方法实验材料实验使用细胞株及培养试剂1.1 人前列腺上皮细胞株购自 ATCC 细胞库；人前列腺癌 PC-3 细胞来自广东省 泌尿外科重点实验室；人前列腺癌 PC-3M 细胞来自吉林大学白求恩医学院。1.2 细胞培养试剂RPMI-1640 培养基 Gibco 公司DMEM：F12 1:1 培养基 Gibco 公司胎牛血清 HyClone 公司Lipofectamine 2000 Invitrogen 公司Opti-MEM I 低血清培养基 Invitrogen 公司细胞培养皿 Corning 公司2.质粒 委托上海吉玛制药技术有限公司设计 4 组 shRNA-PSCA，分别针对 PSCA 的四个不同靶位点。选用载体为带绿色荧光蛋白的 PGPU6/GFP/NEO，构建完成后 测序验证由上海吉玛制药技术有限公司完成。靶点 PSCA 靶序列PSCA-homo-117 TGCTGTGCTACTCCTGCAAAG PSCA-homo-270 GATGACTCACAGGACTACTAC PSCA-homo-542 ACGCAAGTCTGACCATGTATG PSCA-homo-981 GCACAGCGTAGGCCCTTAATA第一部分 人源化抗 HER2 的 ScFv/tp 真核载体的构建阴性对照 部分测序结果3.质粒的扩增及提取3.1 表述上述 shRNA-PSCA 质粒的感受态细菌 DH5α购自上海吉玛制药技术有限 公司。3.2 主要试剂及耗材 胰化蛋白胨 酵母提取物NaCl质粒大提试剂盒天根制药有限公司.细胞质粒转染材料 质粒转染试剂 LIPO2000 购自 转染细胞稳定细胞株的筛选 G418 购自RT-PCR 材料Trizol 试剂美国 GIBICO 公司Primescrept RT-PCR中国 TAKALA 生物科技有限公司10×TAE 缓冲液上海双螺旋生物科技有限公司引物设计设计及检验上海杰瑞公司 引物信息：Western Blot 材料PSCA 一抗（兔抗人）美国 Santa Cruz 公司PI3K 一抗（兔抗人）美国 Santa Cruz 公司5AKT 一抗（兔抗人） 美国 Santa Cruz 公司E-cadherin 一抗（兔抗人） 美国 Santa Cruz 公司Vimentin 一抗（兔抗人） 美国 Santa Cruz 公司内参 GAPDH 抗体（小鼠抗人） 美国 Santa Cruz 公司 二抗（山羊抗小鼠，山羊抗兔） 美国 Santa Cruz 公司 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 美国 Pierce 公司考马斯亮蓝（G-250） 北京华肽先锋生物技术有限公司蛋白质分子 Maker 北京华肽先锋生物技术有限公司还原型 5*SDS 上样缓冲 北京华肽先锋生物技术有限公司细胞裂解液