蛋白微阵列免疫测定在致病菌检测中的要领研究及应用.pdfVIP

摘 要 本论文由四个部分组成：1_研究概况和目标；2．抗体蛋白的提纯和标记；3． 蛋白微阵列芯片在细菌免疫检测中的应用研究；4．蛋白微阵列芯片技术用于2005 年渤海海区4种弧菌及大肠杆菌分布特征的研究。 第一章主要介绍研究概况和目标。综述了生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片 的原理、产生和发展，蛋白质微阵列芯片的制备及一般分析过程及主要的分析仪 器，介绍了蛋白质微阵列技术的国内外研究现状；水体中细菌检测的传统方法、 免疫学方法和生物芯片方法(包括基匠芯片和蛋白芯片)的研究现状等。在此基 础上提出了本论文的主要研究方向，即应用蛋白质微阵列技术实现对细菌的定量 检测，并进一步将此项技术运用于渤海海区海洋致病菌的检测。 第二章主要研究了抗体蛋白的提纯和标记。提纯结果表明盐析法一蛋自A亲和 抗体蛋白，研究标记后抗体蛋白的紫外和荧光光谱等特性，说明Cy3作为蛋白质荧 光标记物更优于F1TC和RBITC，具有摩尔吸光系数高、永溶眭好、易于标记等优 点，作为蛋白芯片标记物具有效率高、荧光强度大、检测灵敏度高、实用的特点。 第三章主要建立了一种用于水体中细菌检测定量(以副溶血弧菌、河弧菌和 大肠杆菌3种细菌作为研究对象)的蛋白微阵列免疫分析法。以Cy3标记抗体蛋白 为探针，蛋白芯片为载体。对孵育反应的IgG(immunoglobulinG，抗体蛋白)浓度、 反应时间、温度、免疫检测方式等条件进行了优化，结果表明：当IgG浓度为 果；在优化条件下采用芯片免疫直接法检测，副溶血弧菌、河弧菌和大肠杆菌的 了比较，结果表明，本方法具有快速、操作便捷、高通量检测、绝对灵敏度高的 特点；将本方法应用于海水样中这3种致病菌定量检测表明本方法具有很好的快 速、准确的特性。 第四章主要介绍了在2005年渤海春季和夏季两个航次中的使用免疫蛋白芯 片检测技术对渤海自然海区海水中的4种海洋致病弧菌和大肠杆菌的存在分布进 行了初步研究，其中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌和大肠杆 菌。由于实际环境中的细菌浓度水平不高，所以使用蛋白芯片检测前需要预富集。 研究结果表明，1)所检测的5种细菌总菌数在夏季的数量要高于春季，其平均菌 定增加，特别河弧菌数量是春季的15．41倍；3)在夏季，渤海湾5种病原菌总数 数为渤海中部的4．68倍，表明所检测的5种细菌的数量由沿岸向渤海海区中部递 减的趋势。在国内对渤海海区大范围的致病菌存在分布的监测研究尚属首次，本 研究结果表明免疫蛋白芯片检测技术用于海洋细菌的常规监测具有很大的发展空 间。 本工作的主要创新点在于；通过对蛋白质微阵列方法的研究，建立了一种用 于水体中细菌检测定量的蛋白微阵列免疫直接分析法，与传统的免疫学检测相比， 本方法具快速、操作便捷、高通量检测的特点；首次将本方法应用于渤海海区5 种致病菌的存在分布研究，研究结果也表明了蛋白质微阵列技术用于细菌检测具 有非常广阔的发展前途和应用前景。 关键词： 蛋白质微阵列：免疫检测；海洋致病菌 ABSTRACT four Thisdissertationconsistsof reviewofthe chapters：1．A protein areviewofbacteriadetection traditional methods，including methodand and method，DNA method；2．Purificationof chip proteinchip labeling detectionofmarine bacteria G)；3．Quantitative IgG(immunoglobulin pathogenic