玉米促分裂原活化蛋白激酶c族mapkk基因zmmkk4的分离及功能分析-isolation and functional analysis of mitogen-activated protein kinase c mapkk gene zmmkk4 from maize.docxVIP

中文摘要非生物胁迫是影响植物生长发育和产量的重要环境因素，而其中又以干旱、低温和 盐渍的影响最为严重。植物在长期的进化过程中形成了一套主动的防御机制，能够识别 逆境信息并通过信号传递最终调节植物的生长发育，从而抵御不良环境的影响。大量研 究表明，在逆境条件下植物体内积累渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等，同 时，许多基因被诱导表达。植物体内存在复杂的信号传递途径，蛋白质的可逆磷酸化反 应对于信号的快速、精确传递起着重要作用。其中蛋白质的磷酸化是由蛋白激酶催化完 成。MAPK级联途径是存在于真核生物中进化上保守的信号通路，在细胞信号的转换和 放大过程中起重要作用。MAPK级联途径由三个成员组成，分别是MAPK、MAPKK及 MAPKKK，此三个信号组分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的方式依次磷酸化，将外源 信号级联放大向下传递。基因的数量显示MAPKK位于MAPK级联途径的关键环节， MAPKKs通过整合不同MAPKKKs接受的多种信号，并将这些信号传递给下游MAPKs。 到目前为止，不同的研究鉴定了多种植物中的MAPKKs，但在玉米中仅分离到ZmMEK1 和ZmMAPKK1。早期的研究发现，ZmMEK1与玉米根尖的增殖有关，另外，该激酶也能 够被NaCl轻微的诱导。关于ZmMAPKK1的功能的研究还未见报道。本研究从玉米品种郑单958根系中分离到一个C组MAPKK基因，命名为ZmMKK4， 对其序列特征、表达模式，以及过表达转基因拟南芥和烟草的抗逆生理功能做了初步研 究。主要结果如下：（1）从玉米分离到促分裂原蛋白激酶激酶ZmMKK4，该基因开放阅读框编码一个357个 氨基酸的蛋白，蛋白序列分析发现该蛋白具有进化上保守的11个蛋白激酶催化结构域， 并且在N端有一个保守的MAPK的锚定位点。进化树分析表明，ZmMKK4属于C族的 MAPKK。（2）构建pBI121-ZmMKK4-GFP表达载体，并在洋葱表皮细胞中瞬时表达。在荧光显微 镜下观察到细胞核内有GFP激发的绿色荧光，说明ZmMKK4定位于细胞核。（3）Northern杂交结果表明，ZmMKK4在玉米根、茎、叶中均有表达，在叶中表达量最 高。低温、NaCl处理和外施H2O2均能诱导ZmMKK4的表达，而外施ABA抑制ZmMKK4 的表达，表明ZmMKK4可能参与调控高盐和低温胁迫，而H2O2信号介导了这一过程。（4）构建 pBI-ZmMKK4 正义表达载体，成功转化拟南芥和烟草。 RT-PCR 和 Westernblot 结果均表明，ZmMKK4 已经在转基因植株中稳定表达。（5）高盐处理条件下，过量表达 ZmMKK4 基因的转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种 子萌发率高，转基因拟南芥幼苗的生长比野生型拟南芥幼苗好。（6）低温处理条件下，过量表达 ZmMKK4 基因的转基因拟南芥幼苗比野生型拟南芥幼 苗的叶绿素含量高，转基因拟南芥植株比野生型拟南芥植株的存活率高。（7）干旱胁迫处理下，过表达ZmMKK4 的转基因烟草的抗氧化能力得到改善。转基因 烟草比野生型烟草细胞内源H2O2积累量少，氧化胁迫较轻。（8）低温、高盐和干旱条件下，转基因植株相容性物质脯氨酸、可溶性糖的积累，以 及抗氧化酶的活性明显高于野生型植株。（9）高盐和低温胁迫下，过表达 ZmMKK4 的转基因拟南芥增强了内源 AtMPK4 的活性。（10）低温、高盐和干旱条件下，过表达 ZmMKK4 的转基因植株增强了胁迫相关基因 的表达。关键词：玉米；MAPKK；基因分离；功能分析；逆境胁迫Isolation and functional analysis of a group C MAPKK geneZmMKK4 in Zea maysAbstractPlants are exposed to biotic and abiotic stresses throughout their life cycle. Drought and salt stress, together with low temperature, are the major factors in reducing plant growth and productivity. However, plants deploy a variety of sophisticated mechanisms to rapidly sense a changing environment and protect themselves from environmental stress. Molecular and cellular responses to these stresses have been analyzed extensively