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miRNA和肿瘤产生相关性研究 　　摘 要 目的：研究miRNA和肿瘤产生的相关性，探讨其能否成为肿瘤产生的指标和miRNA在肿瘤中的作用机制及临床意义，为发现肿瘤的产生原因、预后评估和miRNAs相关治疗新靶点提供理论依据。方法：回顾性分析收治的45例肿瘤患者的临床资料，取AB两组，一组为肿瘤病患者，一组为相应的非病患裸鼠。取患者身上相应的癌细胞，再取裸鼠身上的相应的正常细胞。对45例癌标本进行免疫组织化学染色分析。运用实时定量PCR，比较癌细胞系与正常组织间的相应miRNA区别。对45例癌患者和45例正常对照者运用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对miRNA的多态性进行分型，分析这个位点的等位基因频率。结果：95%miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度的上调或下调，变化均有统计学意义。结论：这一现象初步解释了肿瘤发生与miRNA表达之间存在相关性。 　　关键词 miRNA 肿瘤 相关性 　　 MicroRNA(miRNA)作为一类非编码蛋白质，分布广泛，具有调控基因表达的作用［1］。生物信息学研究显示，单个miRNA对数百个靶基因可以进行调节，这表示所有的信号途径可能会被miRNA影响。本文就miRNA和肿瘤产生的相关性做一初步探讨。 　　 资料与方法 　　 回顾性分析今年上半年收治的45例肿瘤患者的临床资料，其中肺癌患者20例，白血病患者15例，淋巴瘤患者10例。 　　 方法：取A、B两组，一组为肿瘤患病者，一组为相应的非病患裸鼠。取患病者身上相应的癌细胞，再取裸鼠身上的相应的正常细胞。例如肺癌患者，取肺部癌细胞，再裸鼠的肺部细胞。对45例癌标本进行免疫组织化学染色分析。运用实时定量PCR，比较癌细胞系与正常组织间的相应miRNA区别。对45例癌患者和45例正常对照者运用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对miRNA的多态性进行分型，分析这个位点的等位基因频率。在miRNA为杂合子的3种癌细胞株中，运用双荧光标记实时定量-PCR方法(Real-time PCR)对于2个等位基因分别相应的miRNA进行定量比较。运用SPSS 15.0统计软件的Logistic回归、Kaplan-Meier曲线、Cox多因素回归等模块分析上述结果与临床资料的联系。 　　 结 果 　　 在癌组织中相应的miRNA的免??组织化学染色分析表明，高Gleason评分的癌组织较低Gleason评分的癌组织染色强度降低。各组间染色分析结果表明PSA≥100。A组较其他PSA组别染色阳性率减少(P=0.010)；A组较其他分期组别染色阳性率增多(P=0.021)；Gleason评分B组较A组染色阳性率降低(P=0.031)；运用多变量Cox成比例危险因子模型分析表明，阴性miRNA的染色结果是在伴生化复发或肺癌特异性生存的独立预测因素(OR 2.143，95%CI 1.035～4.132；OR 2.365，95%CI 1.194～5.485)。实时定量PCR结果表明，miRNA表达量在肺癌细胞系中较正常肺部组织显着降低，miRNA与原癌基因存在显着负相关(r=-0.678，P＜0.001；r=-0.670，P＜0.001)。研究结果证实，miRNA与肺癌进展为负相关，可能发挥着抑制癌进展的作用。45例癌患者和45例对照组对miRNA运用PCR-RFLP进行分型，含有基因Dicer与肺癌发生转移(D期)的相关性具有统计意义(P=0.010)，Dicer基因型发生肺癌转移的危险性增高(aOR 1.906，95%CI 1.166～3.115)。Dicer基因型在发生病理高分级的危险性增高(aOR 1.646，95%CI 1.076～2.517)。生存分析表明：Dicer基因型在初诊为D期患者的肺癌特异性生存时间显着缩短(P=0.007)；在进行癌细胞清除术后的患者中，Dicer基因在肺癌复发时间显着缩短(P=0.002)。多变量Cox成比例危险因子模型表明，Dicer基因型是预后的独立预测因子(HR 4.658，P=0.019)。研究结果证实，Dicer基因在miRNA结合位点的肺癌的转移及复发具有重要作用。结合通过miRNA与靶基因预测网站分析发现，运用双荧光标记的实时定量PCR，结果表明癌细胞较正常细胞产生的mRNA水平明显升高或降低。发现：①在肺癌中发现Dicer的表达下调，抽查70个非小细胞肺癌样品其中DROSHA及DICER的miRNA表达情况。检测结果显示术后存活期缩短与DICER的表达量下降关联，说明肺组织的转化也许是Dicer阻止的。研究证明缺乏Dicer的鼠胚胎干细胞虽然会产生异染色质不足的情况，但其结果不会导致染色体的结构或者数目不正常。即使注射缺乏Dic