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人类卵母细胞玻璃化冷冻研究进展 　　【摘要】 玻璃化冷冻技术已逐渐成为辅助生育技术中重要的应用技术之一，玻璃化冷冻可避免冻融过程中细胞内冰晶的形成，降低细胞损伤，在人类配子、胚胎的冷冻保存中取得了不少进展。近十几年来，玻璃化冷冻技术已成功应用于成熟卵母细胞、未成熟卵母细胞等方面的冷冻保存并取得成功。该技术操作简单、迅速快捷，正逐渐成为人类辅助生殖技术中重要的应用技术之一。本文综述了玻璃化冷冻技术在保存人类不同发育阶段卵细胞方面的研究进展。? 　　 　　【关键词】 玻璃化冷冻； 卵细胞； 辅助生殖技术 　　?? 　　卵母细胞冻存是辅助生育领域的研究热点之一，冷冻技术主要有程序化冷冻及玻璃化冷冻法。玻璃化冷冻是一种快速冷冻技术，将冷冻对象放在冷冻保护剂中，待细胞脱水及渗透性冷冻保护剂进入细胞且两者达到平衡后，再投入液氮进行冷冻保存。玻??化冷冻可使细胞迅速通过“危险温度区”，使其从液态直接变为无结构的玻璃状态，从而保持溶液状态的分子和离子分布，避免冰晶的形成，减少了细胞的机械性损伤。Kuleshova等［1］在1999年首次运用玻璃化冷冻技术冻存人类的胚胎并获得健康女婴的出生。近年来玻璃化冷冻已广泛应用于人类配子的冷冻保存临床研究［2~7］，并取得了不少进展。? 　　1 玻璃化冷冻的基本原理及影响因素 　　1.1 冷冻原理 研究发现液体在冷冻过程中可形成晶体和玻璃体两种状态。物质在晶体中分子由原有无序状的结构改变为有序的排列；而在玻璃体中分子原有的结构顺序没有改变，仍处于液态中的无序状。液体的性质和降温的速率决定了液体在冷冻过程中以何种状态固化。从理论上讲，只要获得足够的降温速率，任何液体都可以进入玻璃态，但在工作中，形成玻璃态所需的降温速率往往需要通过在溶液中添加冷冻保护剂来实现。玻璃化冷冻中，细胞在高浓度的冷冻保护剂中超高速降温，形成无结构的玻璃态，而不形成冰晶，可避免冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，使细胞在降温过程中保持完整的结构。故自玻璃化冷冻技术问世以来，由于其潜在的优势，已在人类辅助生殖中受到青睐。 　　1.2 影响因素 玻璃化冷冻效果可受多种因素影响，如：冷冻速率、冷冻载体、冷冻保护剂、冷冻及复苏步骤等。玻璃化冷冻是一种快速冷冻技术，细胞从37 ℃快速降温至-196 ℃所需要的时间称为冷冻速率，是玻璃化冷冻技术在保存人类卵细胞和胚胎中的应用非常重要的参数。通过提高温度传导速率可缩短降温需要的时间，即越快越好，但在实际操作中，提高冷冻速率往往会受到限制。为避免在快速降温过程中对细胞的伤害，需要使用冷冻保护剂。玻璃化冷冻液对细胞都有毒性，若浓度过高，对保存的细胞会造成严重的损伤。目前，多数学者认为乙二醇(EG)加上大分子糖类是比较理想的玻璃化溶液的良好候选材料［8］。? 　　2 卵细胞玻璃化冷冻? 　　不同时期的卵细胞对外界环境的敏感性不尽一致。低温会造成卵细胞透明带发生变性，降低卵子的受精能力，因此卵子的冷冻保存成功率较低。研究表明，卵子的玻璃化冷冻较常规的程序化冷冻有较高的存活率和受精率［9］，近年来已取得了不少可喜的进步。 　　2.1 未成熟卵细胞的玻璃化冷冻 未成熟卵细胞(GV)超微结构特点是停留在第1次减数分裂期，染色体分散，存在于核膜内，没有纺锤体。在这个阶段进行冷冻，可以避免冷冻过程对纺锤体微管的损伤，理论上可降低在此后分裂过程中发生细胞遗传学错误的可能性，与成熟卵细胞冷冻相比，存在一定优势。但GV期卵细胞玻璃化冷冻经验非常有限，目前只报道1例GV期卵细胞冷冻保存复苏后经体外成熟并获得活婴分娩［10］。Wu等［11］采用玻璃化技术冷冻人GV期卵细胞，复苏后存活率、成熟率、受精率及妊娠率分别为59%、64%、70%、7%。研究显示，添加二甲亚砜(DMSO)可提高复苏后成熟率［12］。 　　2.2 成熟卵细胞的玻璃化冷冻 成熟卵细胞(MⅡ)微结构特点为停留在第2次减数分裂中期，核膜溶解，染色体位于纺锤体上。由于其表面积与体积的比值小，对水渗透性低，易于发生冷冻损伤。研究发现，适当浓度的EG+DMSO+蔗糖配比组成的玻璃化液毒性小，冷冻和复苏过程中细胞体积变化小，细胞可以耐受，复苏后存活率及妊娠率均有所提高［13］。Chen等［14］研究发现采用平衡液的复苏后存活率可达93%，明显高于不使用平衡液预处理的65%。同时采用单精子胞浆显微注射(ICSI)可弥补透明带硬化带来的受精困难［15］。可见，玻璃化冷冻技术的临床应用及不断发展,使MⅡ卵细胞冷冻后妊娠率及活产出生率得到明显提高。? 　　3 问题与展望? 　　与传统的程序化慢速冷冻相比，玻璃化冷冻明显减少了冰晶的形成，冷冻时间减少，操作简单、经济，显示了极大的优越性。但目前玻璃化冷冻尚未作为常规技术开展，一是对玻璃化冷冻的机制尚不十分了解