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应用Real-time PCR对基因芯片结果验证分析 　　【摘要】目的：应用real-time PCR方法对基因表达谱芯片分析结果进行验证，并提高芯片结果的可信度。方法：从NOR1基因转染HepG2细胞前后的芯片分析差异基因中选择p15和MAGE A6基因，用real-time PCR检测其在转染前后HepG2细胞中的相对含量，与芯片分析结果进行比较。结果：real-time PCR对p15、MAGEA6检测，实验组的表达量分别为对照组的 2.692倍和2.535倍（芯片检测结果分别为2.989和2.118倍），与芯片检测结果具有相同的方向性，且数据非常接近。结论：cDNA基因芯片和real-time PCR分析基因表达变化均可信，基因芯片筛选基因表达谱具有高通量大规模的特点，而real-time PCR则适合单个基因表达变化的研究 ,两者互为补充和印证。 　　【关键词】实时荧光定量PCR；基因芯片；P15；NOR1基因 　　文章编号：1009-5519（2007）21-3187-03 中图分类号：R446 文献标识码：A 　　 　　如果希望筛选特定肿瘤发生、发展和转移等病理过程牵涉的所有基因表达，基因芯片是目前最有效的工具。我们用人17K基因表达芯片对pcDNA3.1(+)质粒转染和pcDNA3.1(+)/NOR1转染后HepG2细胞进行基因表达差异分析。研究结果发现，芯片中共有2倍表达差异的基因/EST 共162条，其中103条表达下调，59条表达上调。这些表达变化显著的基因包括原癌基因和抑癌基因、细胞周期蛋白类、细胞信号和传递蛋白、细胞凋亡相关蛋白等。说明NOR1基因对肿瘤细胞的影响可能涉及到细胞生长的多个方面。为提高芯片结果的可信度，我们选取基因表达谱芯片分析结果中的p15和MAGE A6基因的表达情况应用real-time PCR方法进行实验验证。 　　 　　1 材料 　　 　　转染pcDNA3.1(+)空质粒和转染pcDNA3.1(+)/NOR1的HepG2细胞为本室保存并经鉴定。胎牛血清购自灏洋生物公司，二甲亚砜为 Sigma公司产品。Trizol Reagent 为Invitrogen公司的产品，RT-PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司。TaKaRa SYBR Green Realtime PCR Master Mix。扩增引物（p15： sense 5’-gcg gaa agc ctg taa gcc-3’，antisense 5’-cca tcg gaa gat tcg tag cc-3’；MAGE A6 :sense 5’-cgg tga gga ggc aag gtt c-3’， antisense5’-cgg gag tgt ggg cag gag-3’；18ssense 5’-cgg cta cca cat cca agg aa-3’，antisense 5’-gct gga att acc gcg gct -3’）由上海欧易生物科技有限??司设计合成。 　　 　　2 方法 　　 　　2.1 细胞复苏与培养：分别将转染pcDNA3.1(+)/NOR1（实验组）、pcDNA3.1(+)（对照组）HepG2细胞常规复苏，10%胎牛血清的DMEM培养液培养，根据细胞生长情况传代，收获生长良好细胞。 　　2.2 细胞总RNA抽提：每5×106个细胞加入1ml TRIZOLRNA提取试剂，提取实验组和对照组细胞的总RNA，液氮中保存。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测28s、18s和5s条带变化。 　　2.3 real-time PCR检测P15和MAGEA6的表达差异：根据基因芯片检测结果，我们选取了上调表达差异基因P15和MAGEA6，用18s做内参照，在实验组与对照组样品中分别进行real-time PCR定量检测。 　　2.3.1 cDNA第一链合成：在0.2 ml PCR管中配制12 μl的反应溶液并变性：加入Oligo-dT(15)(0.5 μg/μl)1 μl，总RNA 4 μg，加DEPC水补足，70℃预变性5分钟，冰浴。在上述PCR管中加入5X反应缓冲液4.0 μl，0.1 M DTT 2.0 μl，dNTP mix(10mM) 2.0 μl,RiboLockTM Ribonuclease inhibitor 1.0 μl。置于PCR仪中进行探针标记反应，37℃保温5分钟后，加入Superscript II(200 U/μl,invitrogen)1.0 μl。将PCR管置于PCR仪中42℃保温5分钟后，70℃变性10分钟，4℃保存；将cDNA模板稀释20倍进行下一步反应。 　　2.3.2 制备标准曲线样品：取cDNA模板进行目的基因的PCR扩增，产物连续做10