快速、同时分离九种脂溶性维生素的单次进样超高效合相色谱方法.docVIP

快速、同时分离九种脂溶性维生素的单次进样超高效合相色谱方法 　　应用优势 　　同时分离九种脂溶性维生素及胡萝卜素，可避免使用多种HPLC方法，并且可减少在对膳食补充剂和营养强化食品中的脂溶性维生素进行定性与定量分析时所需要进行的实验步骤。快速分离疏水性维生素及胡萝卜素可显著提升样品通量以及减少实验花费，因而可满足日益增加的法规依从性需求，以监测大量的分析工作。 　　沃特世提供的解决方案 　　配备光电二极管阵列(PDA)检测器的ACQUITY 　　UPC2?系统 　　Empower?3软件 　　ACQUITY 　　UPLC?HSS 　　C18色谱柱 　　关键词 　　维生素、胡萝卜素、脂溶性、维生素A乙酸盐、维生素A棕榈酸盐、维生素D2、α-生育酚、维生素E乙酸盐、维生素K1、维生素K2、番茄红素、β-胡萝卜素、合相色谱分离术、UPC2 　　引言 　　脂溶性维生素(FSV)包括维生素A、D、E、K及类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)。脂溶性维生素参与许多与重要生理功能相关的复杂代谢反应，例如视力(维生素A)、钙吸收(维生素D)、细胞膜的抗氧化(维生素E)、及血液凝固(维生素K)。1β-胡萝卜素是维生素A的前体，且在人体内具有100%维生素A活性。番茄红素不是人体的必需营养素，但它的抗氧化性能使它广受欢迎，越来越多地与其他成分一起被添加到某些膳食补充剂中。几种脂溶性维生素的化学结构如图1所示。 　　维生素及营养补充剂是一个价值几十亿的市场。预计在未来的五到十年，这一市场仍将继续增长。2这是由于全世界的消费者越来越追求更好以及更健康的生活方式，以及越来越注重健康以及饮食习惯。然而，人们也越来越关注从营养补充剂以及营养强化食品中所摄取的脂溶性维生素的安全性问题，特别是维生素A及D，若过量食用，也会带来严重的健康风险。3由于在许多国家，许多针对营养强化食品及膳食补充剂中所添加微量元素的合规性的法律正在拟定或制定中，因此，市场上必然对能够快速、准确地分析不同产品中的脂溶性维生素含量的分析方法有更高的需求。 　　目前，在进行FSV分离时，最常使用的是液相色谱(LC)方法，反向(RP)与正向(NP)方法均有。1,3-5虽然有AOAC法可用于对食品及营养补充剂当中的各种脂溶性维生素分别进行定性与定量分析，但却缺少一种可对维生素预混物中的脂溶性维生素以及类胡萝卜素同时进行分析的方法。 　　3由于超高效合相色谱(UPC2?))分离速度快、经济耐用，因此可考虑将其用于对含有多种脂溶性维生素的药物制剂进行快速分析。6在本应用纪要中，我们阐述了一种单次进样方法，它可在四分钟时间内同时分离九种脂溶性维生素。优化后的方法在保留时间以及峰面积方面具有良好的重现性，且可用于进行高通量定量分析。 　　实验 　　样品描述 　　七种脂溶性维生素：视黄醇乙酸盐(维生素A乙酸盐)、视黄醇棕榈酸盐(维生素A棕榈酸盐)、α-生育酚(维生素E)、α-生育酚乙酸盐(维生素E乙酸盐)、麦角骨化醇(维生素D2)、维生素K1、维生素K2(MK-4)；及两种胡萝卜素：番茄红素及β-胡萝卜素均购自西格玛公司(SigmaAldrich)，并且未经处理直接使用。将所有样品以约mg/mL的溶解到甲基第三丁基醚(MTBE)中，并转移到进样瓶中，准备进行分析。 　　UPC2条件 　　系统：配备PDA检测器的ACQUITYUPC2 　　流速：1mL/min 　　流动相A：CO2 　　流动相B：乙腈 　　色谱柱：ACQUITYUPLCHSSC18x100mm，μm 　　背压：2500psi 　　柱度：30°C 　　样品稀释剂：MTBE 　　进样量：1μL 　　样品瓶：沃特世玻璃瓶12x32mm螺纹颈瓶，2mL 　　PDA扫描范围：210-600nm 　　数据管理：Empower3软件 　　梯度： 　　结果与讨论 　　已有大量文献阐述了利用NPLC及RPLC分离脂溶性维生素以及类胡萝卜素的方法。1,3-5由于在分析脂溶性维生素时，通常需要使用低极性有机溶剂来溶解样本，因此NPLC由于其与有机溶剂的相容性而具有一定优势，可允许直接进样脂溶性维生素或脂溶性维生素萃取物，而不需要进行蒸发步骤。RPLC法的色谱分离效率虽然高于NPLC，7但由于以下几点原因，阻碍了其在进行FSV分析上的应用：1)分析物在流动相中溶解度较低，2)对FSV的保留力强，导致运行时间过长。最终，人们选择使用半水性流动相(甲醇或乙腈与水的混合物)或非水性流动相；后者也称为非水性反相(NARP) 　　LC。7-8UPC2，虽然常作为正相分离技术，但也同样适用于分离极性较低的分析物。UPC2的主流动相CO2不仅是低极性分析物的良好溶剂(与己烷的极性相近)，也可与在样品分离过程中用于溶解这些分析物的有机溶剂(例如本研究中所使用的MTBE)相同。此外，C