固定化酶的酶学性质研究.docVIP

固定化酶的酶学性质研究 　　酸性蛋白酶（acidprotease）是指具有较低最适pH值的蛋白酶，其最适pH值在2.5~5.0之间，在此酸性环境下将蛋白质进行水解，通过内外酶切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸[1].酸性蛋白酶广泛应用于酒类、食醋及酱油的酿造等方面[2-8]. 　　游离态酶稳定性较差、易失活、不能反复使用，通过固定化酶（immobilizedenzyme）技术可以克服游离酶应用的局限性，把酶束缚在一定空间中或水不溶性载体上，既能限制酶分子的自由流动，又能使酶发挥催化作用[9]. 　　海藻酸钠（sodiumalginate,SA）因其温和的凝胶型和无毒性，使它成为最广泛的固定化材料之一[10-12].以SA作为固定化载体材料存在的缺点是其机械强度不够大，这可以通过选择适当的增硬剂来解决[13].阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶均具有良好的机械强度、高内聚力、高稳定性、成膜性等优点，广泛运用于食品加工、医药等领域，与SA复合使用可以增加固定化载体的硬度。 　　目前已有将无机载体或SA等单一天然胶体作为固定化载体材料进行固定化酸性蛋白酶研究的报道[14-17],而将复合天然高分子胶体作为固定化酸性蛋白酶载体的研究则鲜有报道。本实验使用SA分别与3 种天然高分子胶体复合制备固定化酶载体吸附酸性蛋白酶，研究复合凝胶浓度、凝胶比例、CaCl2浓度、固化时间、给酶量、吸附时间、酶液pH值等因素对复合胶体固定化酸性蛋白酶酶活回收率的影响。选择出最优载体进行固定化酸性蛋白酶的制备，对固定化酶的酶学性质进行研究，拟为固定化酸性蛋白酶的实际应用提供理论依据。 　　 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　食品级酸性蛋白酶（酶活力100000U/g） 苏柯汉生物工程有限公司；食品级海藻酸钠 青岛迈潮海洋科技发展有限公司；食品级阿拉伯胶 艾纳提化工科技有限公司；食品级卡拉胶 福建省绿麒食品胶体有限公司；食品级黄原胶 淄博中轩生化有限公司；其他试剂均为分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 游离酸性蛋白酶活力的测定 　　酸性蛋白酶活力的测定采用Folin-酚法（GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》）。酸性蛋白酶活力定义为单位质量的酸性蛋白酶在40 、pH 3.0的条件下，1 min内酶解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1 个酶活力单位（U）。 　　1.2.2 固定化酸性蛋白酶活力的测定 　　取一定质量的固定化酶测定其酶活力，测定方法与游离酸性蛋白酶的测定方法相同。 　　1.2.3 相对酶活力及酶活回收率的计算 　　设定同组酶活力最高的相对酶活力为100%,以同组最高酶活力为参照，计算出的比值为相对酶活力。【1】 　　 　　1.2.4 固定化酸性蛋白酶的制备方法 　　以载体溶液总体积30 mL计，设定复合凝胶质量浓度1.8g/100mL,SA与各胶体质量比为11,称取适量的阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶，分别和SA于60 以下热水中溶解，混合均匀，超声波快速消泡至复合凝胶中无气泡，使用10 mL注射器以约1 滴/s的速率，将复合凝胶滴到质量浓度为4.0g/100mL的CaCl2溶液中，在4 冰箱中固化1.5 h,用纱布滤出载体颗粒，并用缓冲液冲洗3~5 次除去表面的CaCl2.用滤纸吸干表面水分，放入pH 3.0,给酶量1760U/g的酶液中进行吸附，吸附0.5 h后用纱布滤出载体颗粒，用缓冲液清洗，并用滤纸吸干表面的水分。制成的球状颗粒，即所得的固定化酶，在0~4 条件下保存。 　　1.2.5 酸性蛋白酶固定化条件的优化设计 　　1.2.5.1 单因素试验复合凝胶质量浓度对固定化酶活力的影响测定：复合凝胶质量浓度设定在0.6~2.8g/100mL,每隔0.2g/100mL进行测定，其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。 　　凝胶比例对固定化酶活力的影响测定：取复合凝胶质量浓度为各复合凝胶最适条件，海藻酸钠与各胶体质量比例设定为21、31、41、51、61,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。 　　CaCl2质量浓度对固定化酶活力的影响测定：取各已测指标的最适条件，CaCl2质量浓度设定为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0g/100mL,其他因素按照1.2.4节方法固定化制备酶，测定其酶活力。 　　固化时间对固定化酶活力的影响测定：取各已测指标的最适条件，固化时间设定为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力。 　　吸附时间对固定化酶活力的影响测定：取复合凝胶质量浓度、复合凝胶质量比、CaCl2质量浓度、固化时间最适条件，吸附时间设定为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,其他因素按照1.2.4节方法制备固定化酶，测定其酶活力