氯氰菊酯降解菌DZS—的分离鉴定及其特性.docVIP

氯氰菊酯降解菌DZS—3的分离鉴定及其特性 id=“artibody” 　　摘要：以氯氰菊酯为惟一碳源与氮源，从生产氯氰菊酯的农药厂污水曝气处理池的活性污泥样品中，通过富集驯化和划线分离，筛选出一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3。经气相色谱检测，3d内其对氯氰菊酯的降解率为65.7%。形态学观察，该菌圆形，周边光滑，革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌。通过16S rDNA序列分析及生理生化特性鉴定，将其初步鉴定为寡养单胞菌属的一种（Stenotrophomonas sp.）。 　　关键词：氯氰菊酯降解菌;筛选;鉴定;寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.） 　　中图分类号：X172;Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）23-5708-05 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.23.022 　　拟除虫菊酯类（Synthetic Pyrethroids）杀虫剂是一类具有优异生物活性、环境相容性较好的农药，它是继有机磷、有机氯和氨基甲酸酯之后发展起来的一类杀虫剂[1]。该类杀虫剂是模拟植物源农药mdash;mdash;天然除虫菊酯合成的一类含有多个苯环结构的化学农药[2，3]。 　　氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂中的一种，具有高效、广谱、低毒等优点，被广泛应用于果树、蔬菜的病虫防治，但其在环境中有一定的蓄积性，很难在自然条件下快速降解。氯氰菊酯的广泛使用，造成了其在农产品上的大量残留和土壤、河流的污染，给生态环境和人类自身的健康安全带来了极大的威胁。农药残留是影响我国农产品出口的重要屏障，农药残留超标势必给我国的经济造成极大的损失。虽然国内外关于处理拟除虫菊酯类农药残留的方法有很多的报道，但都不能从根本上消除农药残留的问题。如何有效地解决菊酯类农药残留的问题，成为当前人们面临的一大难题。残留在环境中的氯氰菊酯可以通过光降解、化学降解以及微生物的作用被降解。而与化学降解和光降解等方式相比较而言，农药的微生物降解具有安全、高效、费用低、无二次污染等优点，所以，以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物消除技术，也是去除氯氰菊酯残留的一种有效的手段。本研究旨在于分离筛选出新的高效降解氯氰菊酯的菌株，检测其对氯氰菊酯的降解能力，探讨直接用于氯氰菊酯引起的环境污染的微生物修复的可能性。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要仪器设备 自动凝胶成像分析仪，PCR 扩增仪，电泳仪，全自动高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，超净工作台，显微镜，生化培养箱，紫外-可见分光光度计（PE Lambda 25），气相色谱仪（Agilent）。 　　1.1.2 采集样品 从江苏某农药厂曝气池排污口附近土壤采集样品。 　　1.1.3 试剂 K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、NaCl、氯仿、环己烷均为分析纯，琼脂，牛肉浸取物，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeast extract），氯氰菊酯原药（纯度94%）（氯氰菊酯原药使用前先用乙醇或正己烷配成高浓度母液，并过滤除菌）。 　　1.1.4 扩增16S rDNA 引物 primer 27F： 5prime;AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3prime;; primer 1492R： 5prime;GGTTACCTTGTTACGACTT-3prime;。 　　1.1.5 培养基 　　1）基础培养基：MgSO4middot;7H2O 0.5 g，K2HPO4middot;3H2O 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，FeSO4middot;7H2O 1.0 g，去离子水1 L。 　　2）增菌富集培养基：蛋白胨 2.0 g，NaC1 1.0 g，牛肉膏 1.0 g，去离子水 l L，pH 7.0～7.2。 id=“artibody” 　　3）LB培养基：NaCl 10 g，Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，去离子水 l L，pH 7.0。 　　往上述培养基中加入2%的琼脂粉即为固体培养基。 　　1.2 方法 　　1.2.1 氯氰菊酯降解菌的分离纯化 称取污泥5 g，加入灭菌的装有100 mL去离子水的三角烧瓶中，170 r/min、30 ，在摇床上振荡1周，充分释放污泥中的微生物[4]，然后将上清液5 mL和曝气池液体5 mL加入到含氯氰菊酯浓度为50 mg/L的100 mL液体基础培养基中，在摇床上30 、170 r/min培养。按3%的接种量，每7 d转接1次，每转接1次氯氰菊酯浓度提高50 mg/L，直到氯氰菊酯浓度为250 mg/L。交替使用乙醇和正己烷溶解氯氰菊酯以消除溶剂对试验的干扰，确保筛选出的菌株能够利