基因枪介异的籼稻遗传转化及外源基因在受体中的遗传研究.docVIP

基因枪介异的籼稻遗传转化及外源基因在受体中的遗传研究 7,f7/) 武汉植物学研究1999,17(4):!翌=垫 JournalofWuhanBotanicalResearch 基因枪介导的籼稻遗传转化及外源基因 在受体中的遗传研究 凌定厚claudeFauquet25. (1中国科学院华南植物研究所广州510650)75-- (2II|TAB/TSRIORSTOM—ScrippsResearchInstitute,DivisionofPlantBk~logy,, 提要由来自水稻成熟胚的愈伤组织或由此而建立的悬浮细胞系作基因枪转化的靶材料, 将质粒plLTAB227(古hph基因和gua基因)导八籼稻,在Basmati一1,青油粘-新山粘29胜 优2号,明恢63等品种获得了转基因植株.T.转化体gus基因组织化学染色和DNA分子杂 交(Southernbtot)证实,gus和^基囡已整合刊上述品种的基因组中.本实验仔细研究了 hph基因在Basmati一1的_r_,T和T等各个世代的遗传及表达.对_r_家系中各个体核DNA 的分子检测表明,hph基因普遍呈3t1的分离(转基因阳性:阴性),表明^基因为单一位 点的整合,其遗传符合单(显性)基因控制的盂德尔遗传规律还发现一些株系表现11的不 正常的分离(阳性个体较预期的少),推测这是由于雌或雄配子之一方的hph基因受到抑制而 产生基因沉默的结果.在T:T世代获得了具hph基囡的纯合体.笔者还探讨了外源基因在 核基因组中的遗传稳定性及基因的沉默与活化问题. 关键词籼稻,转化,稳定遗传,基因抑制I捆音0仨 水稻是世界上主要的粮食作物,栽培稻中籼亚种的种植面积约占栽培稻全部种植面积的80左 右.传统的作物育种方法对水稻的改良作出了很大贡献,然而遗传工程对水稻的改良提供了更为先进 的方法作为遗传转化方法较为成功的有PEG介导(或电激)原生质体转化法..;幼胚愈伤组织和悬 浮细胞系基因枪转化法～;农杆菌介导法;电激成熟胚.等.在水稻的遗传转化方面,和梗稻相比, 籼稻的难度较大.成功地获得可育转基因植株井对外源基因的遗传稳定性及表现规律方面的报道并不 多见.外源基因整合后在受体中能否稳定遗传,乃是人们关心的重要问题.本文报道外源基因^在水 稻转基因植棒之T,T和T.各世代的遗传行为,表达,及其相应的规律. 1材料和方法 (1)品种:供试的籼稻品种有26窄早,闽129,青油粘,明饿63,胜优2号,新山粘29,新七1号,Bas— mati一1,青二矮及桂朝2号等 (2)质粒载体:质粒pILTAB227古有uidA(gus)和hph基因.分别由CaMV35S启动子驱动.结掏 收稿日,1998672z.修回日:199901—09.第一作者:女,1965年出生.博士.从事作物遗传育种方面研究 国家自然科学基金(4903566),广东省自然科学基垒(940396)和美国Roeke[iUerFoundation(9400010024)资 助课题部分研竞结果. 武汉植物学研究第l7卷 见图1. HiadIIlhmHIHdIII 咖1.62.02.8i0(kb) __薅1__ HindII,BamHI,HmdII限制性内切酶 (RestrictionendOilamp;udease); CaMV35S.启动子(Promoter) 囝1质拉plL.TAB227结构筒围 F.1CoastruetiozzphsmidplLrAB227 (3)靶材料:以愈伤组织及细胞悬浮系为靶材料.愈伤组织来自成熟去壳的种子,灭菌后去壳的种 子接种于MS培养基,添加2,4一D2.0mg/L,以诱导愈伤组织;愈伤组织继代增殖后可直接作为靶材料 供基因枪轰击用.在初级愈伤组织中挑选球形的胚性愈伤在R2培养基中作悬浮培养. (4)转化:转化试验采用PDS—l~O/He基囡枪(13io—Rad公司),根据厂商推荐的条件?将DNA与金 粉充分混合.使DNA包裹到金粉微粒表面上.靶材料在基因抢轰击前进行高渗透压的预处理,即悬浮细 胞系继代后3d,转入具高渗透压的R2固体培养基上(含30g/L甘露醇,30g,L山梨糖醇,30g,L蔗 糖);预处理4h后,将盛靶材料的平皿置于静止屏下8cm处进行轰击,氨气压为1100psi?每批靶材料 轰击2次{轰击后的靶材料在黑暗条件下继续在高渗透压培养基上作后处理. (5)抗性愈伤组织筛选:按Zhang的方法轰击,并在高渗培养基作16~20h的后处理后,将靶材 料转^添加300mg/L水解酪蛋白,2mg/L2.4-D和30mg/L潮霉素B的NB或CC培养基中进行筛 选.在黑暗条件下25～26c作旆选培养2～3周.转化了的细胞由于具砷^基因,对潮霉索B具有抗性, 在选择压下仍然能长出新愈伤组织.将这些抗性愈伤转列