家蝇幼虫抗菌肽defensin基因的克隆、表达、纯化及抑菌、抑肿瘤活性研究-cloning, expression, purification, antibacterial and antitumor activities of defen sin gene from housefly larvae.docxVIP

缩略词（Abbreviation）缩略词英文全称中文全称aaAmino acid氨基酸AMPAntimicrobial Peptide抗菌肽APAmmonium Persulfate过硫酸铵bpBase Pair碱基对β-MEβ-mercaptoethanolβ-巯基乙醇cDNAComplementary DNA互补 DNAdNTPDeoxyribou nucleotide triphos phate脱氧核糖核苷三磷酸E.coliEscherichia coli大肠杆菌EDTAEthylene diaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸钠FBSfetal bovine serum胎牛血清FCMFlow cytometry流式细胞技术HepG2Human hepatoma cell line人肝癌细胞IC50Median inhibitory concentration半数抑制浓度IPTGIsopropyl thio-β-D-galactoside异丙基硫代--β-D-半乳糖IRInhibition ratio抑制率LBLuria-Bertani medium培养基MDMature defensin防御素成熟肽MinMinute分钟MrMolecular weight分子量MTTMethyl thiazolyl tetrazolium四甲基偶氮噻唑蓝ODOptical density吸光度PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应PBSPhosphate-buffered saline磷酸盐缓冲液 PAGEPolyacrylamide Gel Electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDSSodium dodecyl sulphate十二烷基硫酸钠 SIHAThe cervical squamous cancer cells人子宫颈鳞癌细胞 SW480colon cancer cell人结肠癌细胞 TricineN-Tris(hydroxymethyl)Methyl glycine三羟甲基甘氨酸 TrisTris-(hydroxymethyl)-aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷RT-PCRReverse Transcription Polymerase Chain逆转录聚合酶链式反应 Reaction 家蝇幼虫抗菌肽 defensin 基因的克隆、表达、纯化及抑菌、抑肿瘤活性研究 中文摘要 实验目的1. 在实验研究过程中我们对家蝇抗菌肽防御素(defensin)基因进行生物信息学的分析；并应用分子生物学方法从家蝇幼虫体内提取抗菌肽防御素(defensin) 基因，并对该基因进行克隆、表达与纯化。2. 鉴定已纯化的家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)部分对大肠杆菌 E.coli K12D31 的 抑 制 作 用 ； 观 察 抗 菌 肽 防 御 素 成 熟 肽 (MD) 对 肿 瘤 细 胞 HepG2,SIHA,SW480 和对人正常心肌细胞 H9C2 的抑制及杀伤作用；比较该防御 素成熟肽(MD)与羟基脲分别对肝癌细胞 HepG2 的作用效果。3. 观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞 HepG2 细胞周期的影 响；观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞 HepG2 细胞凋亡的影响； 观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞 HepG2 凋亡蛋白半胱天冬氨 酸蛋白酶-3(caspase-3)的影响，从而探究抗菌肽防御素成熟肽(MD)杀伤肝癌细胞 HepG2 的作用机制与原理。实验方法我们对家蝇抗菌肽防御素(defensin) 基因的主要特性进行生物信息学的分 析。应用蛋白质分析专家系统（ExPASy）上的 SOSUI、 ProtParam、HNN、 TMHMM、MotifScan 和 NCBI 上的 ORF finder、Bcepred 等生物信息学在线分 析软件进行分析，并结合 DNAman、Gene Runner 等生物信息学分析软件进行分 析、预测家蝇抗菌肽防御素 defensin 蛋白的可溶性及理化性质、翻译后修饰位 点、跨膜区、亲（疏）水性、二级结构、三级结构及同源性分析，以及遗传关 系的比对等。在 Genbank 中检索家蝇 defensin 基因，根据其设计特异性引物，我们在家蝇幼虫组织中提取 RNA,并通过 PCR 聚合酶链反应扩增 defensin 基因成熟肽部分(Mature defensin, MD)，并将该基因与原核质粒表达载体 pGEX-6P-1 进行质粒重 组，构建家蝇抗菌肽重组蛋白 pGEX-6P-1/MD。通过双酶切鉴定证明目的片段已 稳定融合到载体 pGEX-6P-1 中并将其转化至 BL21(DE3