支配眼部三叉神经神经元cgrp表达的实验分析-experimental analysis of cgrp expression in trigeminal neurons innervating eyes.docx

独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日前言眼部疼痛是常见的临床症状，有些临床疾病如新生血管性青光眼、角膜炎、筋膜炎、眼部手术术后、眼部肿瘤等引起的疼痛常常非常剧烈，严重影响了患者的生活和生存质量。通过药物破坏眼部的痛觉感受器或干扰痛觉信息的传导通道，从而缓解或解除患者的疼痛症状，是一个有待研究的课题。降钙素基因相关肽（calcitoningene-relatedpeptideCGRP）是神经肽的一种，是1983年首次发现的[1]。降钙素基因相关肽CGRP（calcitoningene-relatedpeptide）由37个氨基酸残基构成。人和大鼠都有两种不同的降钙素基因相关肽亚型：人的CGRP亚型分为CGRPⅠ和CGRPⅡ两种亚型，而大鼠则分为α-CGRP和β-CGRP两种亚型。α-CGRP主要产生于神经系统，而β-CGRP不仅产生于肠道神经系统[2]而且产生于免疫细胞，如T细胞[3]。CGRP亚型的编码基因虽然不同，但两者具有高度的序列同源性，两种亚型在大鼠仅相差一个氨基酸而在人则也只差3个氨基酸[4]。CGRP虽然来自降钙素基因，但其分子结构和生理作用与降钙素（calcitoninCT）有着非常大的区别。因为在不同的组织细胞内降钙素基因转录后经过不同的剪接生成CTmRNA和CGRPmRNA，从而决定了其产物的不同。例如，在甲状腺滤泡旁细胞内可转变成CTmRNA，而在神经组织内则转变为CGRPmRNA。分别生成降钙素类肽和降钙素基因相关肽类肽。三叉神经节神经元的胞体内合成的CGRPmRNA，储存于大囊泡内，转运至神经纤维末梢，并在转运过程中完成CGRP的合成。在体内，CGRP分布极为广泛，但主要存在于中枢神经系统和大量外周组织当中[5]。如呼吸系统，消化系统，免疫系统，内分泌系统，心血管系统[6]等。CGRP除具有运动调节，胃肠调节和心血管调节[6]等功能外，还具有强大的感觉调节。CGRP多通过与其受体结合发挥作用[7]。人和大鼠CGRP受体在脑内的分布及其特性相似。在外周神经系统的脊髓背根神经节，三叉神经节等感觉神经节内均含有极为丰富的CGRP阳性细胞和纤维。三叉神经眼支纯为感觉神经，三叉神经眼支分出的鼻睫状神经，是眼球本身的主要感觉神经。此外由其发出的睫状长神经，在眼球后视神经周围经巩膜，进入眼球内，止于睫状体、虹膜和角膜，司一般感觉。还有睫状神经节感觉根，经眼球后部巩膜进入眼球内，司眼球内组织的感觉。研究显示CGRP阳性的三叉神经节神经元参与了角膜，上眼睑的感觉调控，但其是否也参与支配眼球内的感觉？CGRP作为伤害性刺激相关神经元的标记物之一，在眼内内环境变化的情况下是否参与了眼球感觉传递的调节？CGRP拮抗剂的使用是否可以增加三叉神经节神经元末梢的对伤害性刺激的阈值，从而起到缓解疼痛，减轻眼部疾患引起的眼部疼痛症状？本实验应用荧光金逆行标记和CGRP免疫组织化学的方法研究三叉神经节中支配眼部感觉的神经元。探讨CGRP也可能参与了眼内伤害性刺激的传导，干扰CGRP释放及生物活性的药物可能有助于眼部及头面部疼痛的治疗。材料和方法一、材料与试剂雄性S-D大鼠5只，体重（200g±15）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（6683）。多克隆兔抗大鼠CGRP由北京博奥森生物技术有限公司提供。羊抗兔IgG（Trtic）,0.5%tritonx,10%羊血清由武汉博士德生物工程有限公司提供。2%荧光金由上海开放科技有限公司提供。20ul汉密尔顿微量注射器由上海天成科技有限公司提供,荧光显微镜系德国Leica公司生产，由武汉协和医院中心实验室提供。二、荧光金逆行示踪随机抽取SD雄性大鼠3只，编号为1#（195g），2#（200g），3#（195g）。用10%水合氯醛分别行腹腔内注射麻醉,注射剂量采用，体重（g）*0.35ml/100g，15分钟后将大鼠仰卧，观察大鼠不能翻转，腹式呼吸平稳。用生理盐水5ml行双眼结膜囊冲