栉孔扇贝(chlamys farreri)三个性腺发育相关基因的克隆及表达研究-cloning and expression of three gonad development related genes in chla mys farreri.docx

栉孔扇贝（Chhhhllllaaaammmmyyyyssssffffaaaarrrrrrrreeeerrrriiii））））三三三三个个个个性性性性腺腺腺腺发发发发育育育育相相相相关关关关基基基基因因因因的的的的克克克克隆隆隆隆及表达分析 摘要性腺发育是发育生物学研究的重要领域之一，这是一个多基因参与调控的过 程，并且受到性激素和环境等因素的影响。当前人们对于性激素在性腺发育过程 中的作用已经有了很好的认知，然而，有关性激素活化和灭活的相关分子基础和 机制仅在哺乳动物进行了系统的阐述。贝类是动物界中的重要类群，然而其在性 激素合成和降解领域的研究却相当地不足，一定程度地限制了人们对其性腺发育 和调控的理解。本研究以栉孔扇贝（Chlamysfarreri）参与雌二醇、5α-雄烯二醇 和 5α-雄烷-3α，17β-二元醇等激素灭活的 17β-HSD4和 17β-HSD14为研究对象， 从栉孔扇贝转录组数据库中筛选出与其它物种 17β-HSD4和 17β-HSD14高度同源 的两个表达序列标签，采用 cDNA 末端快速扩增技术（RACE）克隆得到这两个 基因的全长 cDNA 序列，进一步采用半定量和定量 RT-PCR 技术，检测了目的基 因在栉孔扇贝各主要组织和不同发育时期性腺中的表达。结果如下：栉孔扇贝 17β-HSD4 cDNA 全长为 2 417 bp，开放阅读框为 2 223 bp，编码 740 个氨基酸，推导的氨基酸序列含有 SDR 超家族的 4 个保守区和 17β-HSD4 的 3 个酶结构域，且与人等脊椎动物的序列相似性均在 58％以上。半定量 RT-PCR 显示该基因在栉孔扇贝精巢、卵巢、肌肉、外套膜、鳃、肝胰腺和肾脏等各组织 中均有表达，其中在肝胰腺和肾脏中的表达量明显高于其他组织，暗示栉孔扇贝 多种组织中均可以合成 17β-HSD4。定量 RT-PCR 结果显示，该基因在性腺不同 发育时期的精、卵巢中表达模式不同；并且在生长期和成熟期的精巢中表达量显 著性高于同时期的卵巢（P＜0.05）；暗示该基因对栉孔扇贝精巢发育和成熟的作 用较卵巢更显著，推测该基因可能通过β-氧化调节脂类物质的积累，从而影响性 腺发育。栉孔扇贝 17β-HSD14cDNA 全长为 1 154 bp，开放阅读框为 819 bp，可编码272 个氨基酸。该氨基酸序列不仅含有 SDR 超家族的 4 个保守区，还含有与17β-HSD14/NADP/estradiol 三元复合物结构相对应的 Lys158-Tyr154-Ser141 三联 体残基，且氨基酸全序列与其他物种的 17β-HSD14 相似性均在 50％以上。定量RT-PCR 结果显示，该基因在不同发育时期精、卵巢中表达的特征与 17β-HSD4的类似，即在生长期和成熟期精巢中的表达量也显著性高于同时期的卵巢（P＜0.05）， 并 且 在 成 熟 期 精 巢 的 表 达 量 明 显 高 于 其 他 各 时 期 。 推 测 栉 孔 扇贝17β-HSD14 可能具有羟基类固醇脱氢酶的活性，并参与雌二醇水平的调节。 进一步，我们从栉孔扇贝精、卵巢差异表达谱中筛选出 10 个两性差异表达的 Tag 片段，通过半定量 RT-PCR 验证，筛选出 2 个卵巢特异表达的 Tag，4 个 卵巢高表达的 Tag 和 1 个精巢高表达的 Tag；以其中 1 个卵巢中特异表达的 Tag（FTYGYVA03G8KDR）序列为基础，设计 RACE 引物，并扩增获得一个 3’末 端含有 22 bp 连续 poly（A）的长为 1 142 bp 的 cDNA 序列片段，GenBank 数据 库比对尚未搜索到同源序列。鉴于其在除卵巢外的栉孔扇贝其它多种组织中均不 表达的特点，推测该序列可能是栉孔扇贝中参与性别分化和卵巢发育的一个未报 道基因。关键词：栉孔扇贝；性腺发育；性别分化；性激素合成；17ββββ----HHHHSSSSDDDD4444；；；βββ----HHHHSSSSDDDloning and expression analysis of three gonad development-related genes in Chhhhllllaaaammmmyyyyssssffffaaaarrrrrrrreeeerrrriiii AbstractThe development of gonad is one of the most important fields in developmentbiology, which is regulated by many genes and is affected by sex hormones and envir