栉孔扇贝(chlamys farreri)wnt4,β-catenin及dax1基因的克隆及其与性腺发育相关性的研究-cloning of wnt 4,β - catenin and dax 1 genes from chla mys farreri and their correlation with gonad development.docx

基酸组成的 ARM 序列，并在细胞信号的传导和细胞骨架的调节等多个生命过程中发挥作用。β-catenin 是 ARM 家族中的一员，其作为一种重要的信号传导蛋白 广泛地参与动物的发育过程。栉孔扇贝（C. farreri）β-catenin 基因 cDNA 序列 全长为 3353 bp，其中 ORF 为 2511 bp，该基因编码 836 个氨基酸。推导的 β-catenin 氨基酸序列高度保守，并含有 ARM 家族特有的重复序列及典型的 N-末端及 C- 末端区。半定量 RT-PCR 结果表明：β-catenin 亦在扇贝的多种组织中表达；qRT-PCR 结果显示：随着性腺的发育和成熟，β-catenin 在性腺中的表达量逐渐 升高，并在成熟期达到最高，随后的休止期性腺中表达量急剧下降到最低水平； 与此同时，β-catenin 的表达还呈现出性别二态性模式，即在卵巢中的表达量显著 高于同时期的精巢（P0.05）。免疫组织化学结果显示，栉孔扇贝（C. farreri）β-catenin 蛋白主要定位在生殖细胞中，即精巢中的精原细胞和精母细胞、卵巢中 的卵原细胞和卵母细胞，这一表达特征暗示了该基因可能参与栉孔扇贝（C. farreri）两性配子的发生过程。DAX1 [dosage-sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenital (AHC) critical region on the X chromosome gene 1]是核受体超家族的一员，在几个脊椎动 物物种中被认为参与性别决定及性腺发育。栉孔扇贝（C. farreri）Dax1 基因 cDNA 全长为 2093 bp，其中包括 1404 bp 的 ORF，编码 467 个氨基酸。栉孔扇贝（C.farreri）DAX1 蛋白在其假定的 DNA 结合区中没有哺乳动物类的 LXXLL 保守序 列。荧光原位杂交技术标定栉孔扇贝（C. farreri）Dax1 基因位于一对亚端部着 丝粒染色体的短臂上。半定量 RT-PCR 结果显示，栉孔扇贝（C. farreri）Dax1 基因在所有检测的组织中均有表达；qRT-PCR 检测栉孔扇贝（C. farreri）不同发 育时期的性腺（增殖期，生长期，成熟期）中均表达 Dax1 基因，且在性腺中也 呈现性别二态性表达特点，但其在精巢中的表达量显著性高于同时期的卵巢（p0.05）；与 β-catenin 蛋白的细胞学定位一致，栉孔扇贝（C. farreri）DAX1 蛋白也定位在精巢中的精原细胞、精母细胞以及卵巢的卵原细胞、卵母细胞中， 表明 DAX1 可能参与了栉孔扇贝的配子发生过程。抑制剂实验结果显示，当向栉孔扇贝（C. farreri）精巢细胞体外原代培养体 系中添加 0.1 μg/ml 和 0.2 μg/ml 的 DKK-1 48 h 时，qRT-PCR 检测发现，原代培 养细胞中的 β-catenin 表达量显著下调（p0.05），表明在栉孔扇贝（C. farreri）精巢中存在经典的 Wnt 信号通路。当向栉孔扇贝（C. farreri）精巢细胞体外原代培养体系中添加 50 μmol/L 和 100 μmol/L 的槲皮素时，处理 48 h，Dax1 基因的 表达量显著性降低（p0.05），暗示 Dax1 作为 β-catenin 的下游基因参与性腺的 发育和配子发生过程。关键词：栉孔扇贝；Wnt4；β-catenin；Dax1；性腺；配子发生；DKK-1；槲皮素Cloning of genes Wnt4, β-catenin, Dax1, and their correlation to the gonadal development in scallop Chlamys farreriAbstractGonadal development is one of the major research fields in the developmental biology. It has been cognized to some extent on genes of gonadal development in vertebrates especially in mammals. While, limited information about the field is available in invertebrates especially in marine bivalves. In the present study, we cloned full-length cDNA sequences of the genes Wnt4, β-