栉孔扇贝(chlamys farreri)能量代谢与抗氧化胁迫能力评价指标体系构建-construction of evaluation index system for energy metabolism and antioxidant stress ability of chla mys farreri.docx

栉孔扇贝（Chlamys farreri）能量代谢与抗氧化 胁迫能力评价指标体系的构建摘要栉孔扇贝（Chlamys farreri）是我国本土重要的经济贝类之一，自然分布于 山东半岛以及辽东半岛沿海地区。近年来，养殖区栉孔扇贝在夏季频发出现大规 模死亡，造成严重的经济损失。国内外学者从环境生态学、病原学、贝类免疫学 以及种质遗传学等多个角度对其进行了研究，但迄今尚未找到十分有效的解决办 法。本研究通过分析栉孔扇贝正常生长、衰老过程中代谢及抗逆相关生理指标的 变化，结合相关调控基因的表达分析，从分子及生化水平较为系统的研究了生殖 及高温胁迫下扇贝各组织能量代谢及抗氧化能力的变化，为指导扇贝抗逆品系的 选育，阐明扇贝群体夏季大规模死亡的原因提供参考。1、栉孔扇贝抗逆相关评价指标体系的构建 我们分析了稳态维持相关的端粒调控、全基因组甲基化水平、能量代谢以及抗氧化能力在 1-4 龄栉孔扇贝中的变化情况。端粒研究结果表明，端粒长度、端粒酶活性及相关基因的表达之间显著相关，但仅在 4 龄栉孔扇贝肝胰腺中表现出 显著的端粒长度缩短以及 TERT 表达下降（P0.05）。全基因组甲基化水平分析 结果显示，不同年龄组间外套膜、肾脏及肝胰腺的 DNA 甲基化水平差异显著（P0.05），随年龄增长呈下降趋势；外套膜及肝胰腺的 DNMT1 表达在 1、4 龄实验组间有显著差异（P0.05）。此外，研究结果表明，能量代谢及抗氧化相 关指标（SOD、CAT、GOT、GPT、LDH、ROS、MDA、ATP）在栉孔扇贝大 部分组织中与年龄显著相关（P0.05），呈现出一致的增龄性变化规律。因此， 本研究选择组织中广泛存在且年龄组间变化显著的能量代谢及抗氧化相关指标， 通过主成分分析，建立组织特异性综合指数表达式，例如在肾脏中，综合指数N 肾脏=0.30*LDH+0.29*ROS+0.29*ATP+0.27*MDA+0.25*GPT+0.21*CAT+0.18*SOD+0.07*GOT。分析结果显示，本研究构建的组织特异性抗逆综合指数与年龄呈现显著负相关，与组织能量代谢水平及抗氧化胁迫能力呈正相关，且肾脏中指数的变化与年龄相关性最好（r=0.82，P 值=9.22e-11）。2、生殖及高温胁迫对栉孔扇贝能量代谢及抗氧化胁迫能力的影响 我们利用构建的栉孔扇贝组织特异性抗逆相关评价指标体系，分析了生殖及高温胁迫对栉孔扇贝各组织能量代谢水平及抗氧化能力的影响。基础生化指标测 定结果显示，与正常扇贝个体相比，繁殖期栉孔扇贝大部分组织的 SOD、CAT、 GOT、GPT、LDH 酶活力水平以及 ROS、ATP 水平在大部分组织中显著下降（P0.05），其中性腺的抗氧化酶活力降幅达 90%，ATP 水平降幅达 80%；另外， 产后外套膜、鳃、性腺、肾脏、闭壳肌及肝胰腺的综合指数显著下降（P0.05）。 30°C 高温刺激生存曲线分析结果表明，1 龄实验组存活率显著高于 2 龄以上实验 组（P0.05）。统计显示，12.5h 时 1 龄实验组存活率达 89.69%，2 龄实验组存活 率达 37.72%，而 3、4 龄及产后实验组存活率已低于 15%。分析结果表明，高温 胁迫下组织基础生理指标仍呈现增龄性下降趋势，1 龄实验组综合指数显著高于 其他实验组（P0.05），与正常 1-4 龄检测结果一致。高温胁迫前后比较分析结 果显示，2 龄以上实验组扇贝组织能量代谢及抗氧化胁迫能力评价综合指数在高 温刺激后显著下降（P0.05）；1 龄大部分组织该综合指数变化不显著，但肾脏 及肝胰腺综合指数在高温刺激后反而呈显著上升（P0.05）。本研究结果表明， 生殖及高温胁迫均可造成栉孔扇贝组织抗逆性综合指数下降，暗示了这两种因素 均可对扇贝的能量代谢水平及抗氧化能力产生显著影响。3、生长、代谢、衰老及繁殖相关基因调控通路表达分析参与调控 Mn-SOD 、 CAT 、 GPT 等 转 录 活 性 上 游 的 PI3K-AKT-TOR 、 IGF-1r-AMPK-FOXO 及 P53-Sestrin 通路相关基因表达分析结果显示，栉孔扇贝 大部分组织中包括 PI3K、IGF-1r、AKT、AMPK、TOR 等基因在内的通路衰老正 向调控轴基因在正常情况及高温胁迫下均呈现增龄性表达上调的趋势，且在产后 及高温刺激后的部分组织中表达显著上升（P0.05）。肾脏中，PI3K、IGF-1r、 AMPKα/γ、FOXO、P53 在不同年龄组间差异显著（P0.05）。产后，性腺中 PI3K、AKT、IGF-1r、AMPKα/β 表达显著上升（P0.05），同时 TSC2、FOXO 表达显著下降（P0.05）。高温刺激后，通路相关基因的表达水平在性腺、肾脏、肝胰 腺中变化显著（P0.05）。通路基因