甲基强松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用研究.docVIP

甲基强松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用研究 　　[摘要]目的观察甲基强的松龙(MP)对深低温停循环(DHCA)大鼠脑N－甲基－D－天门冬氨酸受体R1(NMDAR1)表达的影响，探讨MP对DHCA大鼠脑保护作用的机制。方法 制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只，随机分为假手术组、DHCA模型组和MP处理组。观察DHCA 60min，再灌注2、6、12h及1、2、3、7d时NMDAR1蛋白表达的变化以及脑组织超微结构变化。结果 免疫组化结果显示，DHCA模型组和MP处理组大鼠NMDAR1蛋白表达均升高，于1d到达高峰，后逐渐降低，于再灌注7d恢复至正常水平。MP处理组大鼠再灌注后2、6、12h，1、2 d 5个时间点NMDAR1表达明显低于模型组(P＜0.01)。脑组织超微结构观察发现MP能抑制DHCA脑细胞凋亡。结论 MP对DHCA大鼠脑组织具有保护作用，其作用机制之一可能是与抑制NMDAR1蛋白表达有关。 　　[关键词]深低温停循环；甲基强的松龙；N－甲基D－天门冬氨酸受体R1；脑保护；蛋白表达 　　[中图分类号]R33；Q786　[文献标识码]A　[文章编号]1671－7562(2007)04－0283－04 　　 　　深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)技术自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中，但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决，DHCA术后中枢神经系统的发病率高达4％－25％。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐，远期出现认知障碍，儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸(EAA)大量释放和再摄取减少，从而激活突触后N－甲基－D－天门冬氨酸(NMDA)和α－氨基－3－羟基－5－甲基－4－异戊丙酸(AMPA)受体，引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流，造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙(MP)对DHCA大鼠脑NMDA受体1(NMDAR1)蛋白表达的影响，以探讨其脑保护机制。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　仪器与试剂 　　早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛(南京市儿童医院提供)、MP(美国辉瑞制药公司)、NMDA受体R1(santa Cruz公司)，羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022(武汉博士德公司)、DAB显色剂(武汉博士德公司)、多聚赖氨酸(美国Sigma公司)、荧光倒置显微镜(德国蔡司)、801???像分析系统(江苏捷达)。 　　 　　1．2　动物 　　成年健康雄性普通级SD大鼠(南京医科大学实验动物中心)175只，体重250－300g，随机分为3组，A组(假手术组)15只；B组(DHCA模型组)和C组(MP处理组)各80只，每组再分为DHCA后2、6、12h，1、2、3、7d共7个小组，每小组10只，其中DHCA后6h、1d两个组为15只。术前6h禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉，不降温不阻断；B组深低温停循环60min；C组于深低温停循环前30min腹腔注射MP，剂量为30mg?kg-1。 　　 　　1．3　大鼠DHCA模型建立 　　术前30min肌肉注射阿托品0.02 mg?kg-1，5％水合氯醛6ml?kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插人肛门3cm，用胶带将其与鼠尾相固定，监测肛温。 　　颈部正中切口，分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉，并双重过线。游离一侧股动脉，动脉置管，取动脉血做血气分析后，用肝素充满连接管后接压力换能器，多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝，物理降温，每隔5min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21℃时，将大鼠取出，取动脉血做血气分析后，经左股动脉进行肝素化(肝素钠300IU?kg-1)。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉，扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉，最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉，扎线固定留置针，与左侧颈外静脉的静脉留置针相连，开始转流。转流后，将体温维持在(21±1)℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60min后，拔出颈外动脉处留置针并结扎，回收其管道内血液，经左侧颈外静脉输入，再退出其管内留置针并结扎。最后松开两侧颈总动脉处动脉夹，恢复颈总动脉血流，检查穿刺处无出血后，逐层缝闭切口。然后将大鼠放人35℃早产儿培育箱复温，恢复正常体温4h后放置室温下正常饲养。 　　 　　1．4　免疫组化方法检测NMDAR1蛋白表达 　　各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点，用含4％多聚甲醛的0.1