诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响研究.docVIP

诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响研究 　　摘要：目的研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响，探讨包涵体质量评价体系。方法在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体，研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性，分析诱导时间与包涵体复性率的相关性。结果诱导时机不同，所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同，在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同。复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解，对化学变性剂的稳定性也高。结论诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率。 　　关键词：羧肽酶B；诱导时机；包涵体；蛋白酶K 　　中图分类号：Q518.4文献标识码：A文章编号： 　　1672?979X(2009)07?0017?04 　　 　　随着基因工程和蛋白质工程的发展，现已能按照需要设计和生产具有各种特殊用途的蛋白质。其中难题之一是???因工程产物往往以没有生物活性的包涵体(inclusionbodies，IBs)形式存在。已知70％以上的重组蛋白质在大肠杆菌中形成不溶的IBs，且大多数IBs蛋白质的复性率不超过10％，有的甚至完全不能复性。减少IBs的形成数量或者提高IBs的复性率是基因工程和蛋白质工程亟待解决的问题。 　　研究表明，以IBs形式表达的重组蛋白质未必完全失去活性[2]IBs蛋白质的重要特点是存在二级结构和有抵抗蛋白质水解的能力[3，4]。如可溶性和IBs形式的半乳糖苷酶的比活具有同样的数量级[1]；偶联了荧光蛋白的IBs荧光蛋白可发出高强度荧光，都证明IBs蛋白可以保持部分蛋白质的天然结构[2]。Groot等[5]用与帕金森症相关的Aβ42肽偶联荧光蛋白研究了在大肠杆菌中表达蛋白质聚体的活性与培养温度的相关性，发现二者呈负相关。与之相反，温度升高有助于提高IBs应对化学变性或水解时的稳定性。 　　本课题组对重组羧肽酶原B进行了较系统的研究[6，7]。以重组羧肽酶原B为模型，研究了诱导时机对IBs质量和复性的影响。结合IBs复性率，对评价IBs质量的方法进行了初步探索，并由此得到了最佳诱导时机。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1菌株与质粒含有表达质粒pET21a?proCPB的表达菌株BL21(DE3)系本实验室保存。 　　1.1.2培养基LB液体培养液：1％蛋白胨(Oxoid)，0.5％酵母提取物(Oxoid)，1％氯化钠；LB固体培养基另含有1.5％琼脂。 　　1.2方法 　　1.2.1蛋白质表达和包涵体洗涤取表达菌株单克隆，转入含有100μg/mL氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB培养液中，37℃培养过夜，作为一级瓶。按2％的接种量转入二级瓶(100μg/mLAmp)培养，培养不同时间后分别加入终浓度0.5mmol/L异丙基?β?D?硫代半乳糖苷(isopropy?β?D?thiogalactoside，IPTG)诱导表达。加入诱导剂之前的培养时间称为诱导时机。从转入二级瓶到收菌的总培养时间为12h。不同收菌时间是指在优化出最佳诱导时机后，从加入IPTG到收菌的表达时间。4000r/min离心30min，弃上清，菌体用pH8.0，浓度20mmol/L的Tris?HCl悬浮，超声波破碎菌体，10000r/min离心15min，收集沉淀。用pH8.0含1％TritonX?100的20mmol/LTris?HCl洗涤，离心10min得沉淀，再用pH8.0，20mmol/LTris?HCl充分洗涤沉淀2次，得到较纯净的IBs[8]。 　　1.2.2生长曲线测定一级瓶培养过夜，按照2％接种量转接二级瓶，隔0.5h取样。以空白LB培养基为参比，在600nm处测吸光度A，对时间作图，得生长曲线。 　　1.2.3IBs的变性和复性称取一定量的IBs，按20mg/mL的比例加入8mol/L尿素，室温温和溶解2h，离心，取上清，缓慢滴入复性液(pH9.5甘氨酸?氢氧化钠缓冲液)中，室温下，静止复性24h，调pH8.0，37℃胰蛋白酶酶解2h，测酶活性。 　　1.2.4酶活性测定方法[9]测定前新鲜配制0.001mol/L马尿酰L?精氨酸的盐溶液。总测定体系3mL，测定波长254nm。加入酶溶液5～20μL，立即调节灵敏旋钮至吸光度为零，间隔适当时间记录A值。调酶浓度到10min内水解反应不超过30％。完全水解的A值为0.36。在测定范围内，数据显示底物的水解速率与酶浓度呈明显的正相关。一个酶活性单位定义为每1min水解1μmol底物所需要的酶量。由A254nm的变化计算酶活性。复性率以复性液中酶的总活性单位表示。同时测定蛋白质浓度，计算比活。 　　酶活性=[SX(]ΔA254(A254nm/t)[]