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酶联免疫吸附试验影响因素分析及控制方法 　　文章编号：1005-619X（2007）08-0480-02 　　 　　酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种非均相免疫分析技术，具有操作简便、特异性强、重复性好等优点，广泛用于各种抗原和抗体的检测，是目前临床实验室主流的免疫学检测方法。但由于影响ELISA的因素较多，用适当的方法控制影响因素是保证实验准确性的重要手段，本文详尽分析了试验的影响因素及控制方法，以期同行参考。 　　 　　1 试剂因素 　　 　　1.1ELISA是将酶的催化作用与抗原抗体免疫反应相结合的一种分析技术，低温试验材料影响抗原与抗体免疫反应的特异性，也降低酶本身的催化活性，从而影响实验结果，故从冷藏环境中取出的试剂及微孔反应板置37℃平衡30min后方可使用，余者应封存冰箱中储藏备用。 　　1.2鉴于目前生产ELISA试剂盒的厂家众多，所用固相载体的种类、酶的纯度、抗原抗体成分及生产工艺不同，其敏感性和特异性亦不同，要选购相对知名度高具有“三证”的试剂盒，使用前最好验证试剂质量，使PCX与NCX比值达到质量合格要求。 　　1.3勿混用不同厂家不同批号的试剂和过期失效的试剂，即使是同一厂家生产的洗涤液和显色剂也不要通用，以确保结果的准确性。 　　 　　2 标本因素 　　 　　2.1标本中非特异性物质形成的免疫复合物易于吸附在固相载体的表面，造成假阳性。用含有0.05%TweeN-20的洗涤液充分洗涤，可消除非特异物质由于吸附所引起的影响。对于类风湿患者，因血清中IgM、IgG型类风湿因子可与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗FC段直接结合，从而导致假阳性。控制影响的方法是：①用F(ab)2替代完整的IgG。②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。③检测抗原时，可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。补体的影响是在ELISA系统中固相一抗和标记二抗反应过程中，抗体分子发生变构，FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使Clq将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本。②用56℃ 30min加热血清使C1q灭活。溶血的影响主要是反应板对血清中Hb的非特异性吸附和细胞内液对血清的稀释作用。Hb具有类过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，如果反应板非特异性吸附Hb而残留，则可催化底物显色引起假阳性。控制的方法是：①要注意采血手法，离心速度，孵育温度，避免组织液过多的进入血液。②采用二步法操作可以排除Hb对ELISA的影响。③良好的洗涤效果可减少非特异吸附的干扰。 　　2.2 标本在冰箱中保存过久，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。标本放置24h以上，有时抗原抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。标本若受到细菌的污染繁殖消耗血清中的有机物包括免疫标志物，使抗原和抗体浓度下降。控制的方法是：①血清标本宜新鲜采集及时测定。②若结果需要复查免疫标志物含量低的标本室温可放置3天，4℃～8℃放置5天，免疫标志物含量高的标本室温放置两周，4℃~8℃冰箱放置4周，需长时间保存的血清标本最好置-20℃或-70℃冻存[1]。需要注意的是冻存后融解的标本，蛋白质局部易浓缩，分布不均，应轻柔充分混匀后再测定。 　　2.3 必要时重复制备不溶血样品，发生溶血而又不易重复获得的样品，应根据溶血程度对测定结果做出合理评估。值得注意的是在检测抗HCV、抗HIV时，溶血样品经过多倍稀释后，Hb很难被竞争吸附到反应板上，所以溶血不影响抗HCV、抗HIV的测定[2]。 　　 　　3 操作因素 　　 　　3.1 在ELISA中，酶标反应板上的包被物是一个相对值，抗原与抗体反应存在最适比例和hook效应，该试验对过高或过低浓度的抗原抗体都不能检出。一步法是把待检样品和酶标物一并加入包被好的反应板中进行反应，引起竞争机制产生hook效应。控制的方法有：① 常用的是用二步法替代一步法操作，可提高实验的灵敏度防止假阴性。② 用简便的EIA-斑点膜渗滤法可以完全消除hook效应[3]。③ 用胶体金免疫层析法防止hook效应更快捷，1min就可判读结果[4]。 　　3.2 在加样品稀释液和底物时，由于滴瓶的口径不规范、滴加的角度不同和挤压的力度变化，容易使滴加的试剂量不准而影响结果，所以定量的实验试剂最好用加样器加注，并经常校正其准确度，做到一人一个移液头，防止交叉污染。在底物过量的情况下，有色产物随时间的延长而增加，故底物的加入时间应一致。用全自动加样机时，应防止拖带污染现象，当同一行或同一列上出现连续阳性时，经复查后再报结果。当一份标本检测较多项目时，先做ELISA后做其它项目为宜。 　　3.3 洗板是该试验中