重组瘦素诱导HSC增殖及保肝宁调控作用实验研究.docVIP

重组瘦素诱导HSC增殖及保肝宁调控作用实验研究 　　【摘要】目的：探讨中药复方保肝宁对外源性瘦素(leptin)诱导的肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)增殖功能的影响及其保肝宁调控作用的可能机制。方法：给正常Wistar大鼠灌胃保肝宁煎剂7天，制备含药血清，用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolylium，MTT）检测保肝宁对leptin刺激HSC-LX2增殖的影响；应用蛋白印迹实验(Western blotting analysis)检测的P-JAK2蛋白表达水平。结果：保肝宁组作用HSC-LX2 6小时后，P-JAK2蛋白的表达水平开始降低，P-JAK2处于最低水平。与正常血清组比较，保肝宁组较秋水仙碱组更能降低P-JAK2蛋白表达水平。结论：中药复方保肝宁有阻断leptin诱导HSCs-LX2增殖的作用，而抑制P-JAK2蛋白的表达水平可能是其主要的机制之一。 　　【关键词】保肝宁；瘦素；肝星状细胞；P-JAK2 　　文章编号：1009-5519（2008）13-1897-02 中图分类号：R28 文献标识码：A 　　 　　外源性瘦素（leptin）是由肥胖基因（obese gene）（位于人类染色体7q31.3)编码的一种167个氨基酸组成的分泌型蛋白质，是新发现的促肝纤维化的细胞因子[1]。最近研究显示，leptin具有诱导肝星状细胞（HSC）活化和增殖作用。leptin与肝纤维化具有密切关系，对其机制的研究已越来越受到关注[2]。由于国内外的研究尚处于起步阶段，因此探明保肝宁与leptin及肝纤维化的关系，可能有望成为揭示保肝宁抗肝纤维化机制新的切入点，对肝纤维化防治具有重要的临床和理论价值。本实验为进一步探讨中药复方保肝宁对一定浓度leptin刺激HSC-LX2增殖的抑制作用，并明确其产生抑制作用的信号传导途径和作用机理，现报道如下。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料和仪器：leptin购自protech公司，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，MTT购自广州普博公司，P-JAK2、HRP标记的山羊抗兔抗体及actin购自北京中山公司。 　　1.1.1 细胞培养：HSC-LX2由美国纽约西奈山医学中心Scott.Friedman教授馈赠。HSC-LX2以含10%胎牛血清的RPMI1640培养于含5% CO2饱和湿度的37 ℃环境中。 　　1.1.2 药物血清的制备：（1）煎煮中药：保肝宁的方药购自南方医院中药房，煎煮配制成1.77 g/ml，3.54 g/ml浓度的药??。秋水仙碱购自西双版纳制药厂，配制成0.05 g/ml的药液。（2）制备含药血清过程：wistar大鼠24只雌雄各半，体重200~230 g，清洁级，购自南方医科大学实验中心。随机分为4组：正常组、保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组、秋水仙碱含药血清组。除正常组给予相应剂量的生理盐水，其余各组每日按1 ml/100 g经胃灌药1次，连续7天。最后一次灌药（灌药前禁食不禁水12小时）1小时后，腹主动脉采血，离心分离血清，56℃水浴中灭活30分钟，0.44 ?滋m微孔滤膜过滤，-20 ℃冷藏备用。 　　1.2 MTT比色法：选择复苏后处于对数生长期的HSC-LX2，每孔0.5×104个细胞，37 ℃、5% CO2温箱中培养24小时后，弃去培养液，分别加入含100 ng/ml leptin的各组含药血清，每孔200 ?滋l，6孔重复。继续培养24小时后弃培养液，各孔加入20 ?滋l的MTT溶液混匀，37 ℃培养4小时后，小心吸去上清，于每孔加入200 ?滋l DMSO混匀室温下，将平板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，用酶标仪测定600 nm处光吸收值（OD），并计算增殖率（%）。 　　1.3 Western blotting analysis：按常规方法提取各组细胞蛋白，6%SDS电泳，用Biorad微型电转移系统于4 ℃、60V电转移3小时至PVDF膜上。室温封闭1小时。一抗为兔P-JAK2蛋白多克隆抗体(1∶1000稀释)室温孵育1小时，二抗为HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶2500稀释)在室温孵育1小时。应用化学发光试剂显色，曝光，X胶片经显影、拍照记录。 　　1.4 统计学处理：用SPSS10.0统计学软件分析及作表，OD值以x±s表示；采用单因素方差分析。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 中药复方保肝宁对HSC-LX2细胞生长的影响：与正常血清组比较，保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组均能明显抑制HSC-LX2的增殖(P＜0.01)，秋水仙碱组亦能抑制HSC-LX2细胞的增殖(P＜0.01)；与秋水仙碱