重组羧肽酶原B突变体C383A纯化与性质研究.docVIP

重组羧肽酶原B突变体C383A纯化与性质研究 　　摘要：目的纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质。方法用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A，测定其动力学参数，温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质，并与野生型比较。结果纯化后获得高纯度突变体C383A，与野生型相比，催化效率及稳定性均有提高，但与底物的亲和力降低，随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型。结论将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响，与野生型比较，C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性。 　　关键词：重组羧肽酶原B；定点突变；纯化：酶学性质 　　中图分类号：Q555 　　文献标识码：A 　　文章编号：1672-979X(2010)09-0308-05 　　 　　羧肽酶B(ca rbOXypeptida s e B，cPB)(EC3.4.17.2)属金属羧肽酶家族，是一种切割蛋白质或多肽c端Arg、Lys等碱性氨基酸残基的外肽酶，主要应用于蛋白质切割和测序以及疾病诊断，以及重组胰岛素的生产工艺中。 　　羧肽酶原B(45×10)由胰蛋白酶激活生成有催化活性的羧肽酶B(35×103)。制备羧肽酶B的传统方法是从动物胰脏中提取，繁琐且成本很高。我们已成功构建鼠源羧肽酶原B(pCPB)大肠杆菌BL21(DE3)高效表达菌株，以包涵体形式表达并成功复性。羧肽酶原B Cys383位点在c端a－螺旋二级结构中，此位点靠近酶活性中心。Cys383被Ala替换后，酶的催化域构象及电荷分布可能发生改变，从而影响其酶学性质。为弄清Cys383位点对酶的性质的影响，我们构建突变体c383A表达菌株，并研究了复性后纯化和酶学性质。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　LB培养基：1 L培养基含胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，氯化钠lOg。 　　PCR引物(上海生工生物公司合成)；DNA测序(上海英骏生物技术公司测定)；高保真酶pyrobestDNA polymerase、限制性内切酶、DNA连接酶T4Ligase[宝生物工程(大连)公司]。其余试剂均为分析纯。 　　 　　1.2方法 　　1.2.1突变体C383A表达菌株的构建由于c y s 3 8 3位点位于c端，a一螺旋结构靠近c端，故以含野生型序列的质粒为模板，直接采用3’.端引物引入突变位点。引物设计为，5’端5’.CATGCCATGGAACATGCTTCCGAGGAGC-3’(含Nco I酶切位点)；3’端5’－CCCAAGCTTTCACTAATATAGATGTTCTCGGACATAATT GGCAATGTACTTGACTGCAAGCATTGTCTCCTCACGGTCTGGCGGA-3’(含Hindm酶切位点)，突变序列PCR扩增后连接至pET-28a(+)(Novagen)表达载体。选用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株(由本实验室保存)。 　　1.2.2酶活性及蛋白质浓度测定羧肽酶的活性测定根据Folk and Schirmer[71法，以马尿酰－L－精氨酸为底物，将25℃，1min催化降解1 umol马尿酰-L-精氨酸所需的酶量定义为1个酶活性单位(u)。蛋白质浓度用Bradford法测定，用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白。 　　1.2.3C383A的纯化用20 mmol／L Tris pH 8.0平衡DEAE.FF离子交换树脂，将复性液酶解过滤后上样，经Tris.HCI缓冲液平衡后，用含0～0.3 mmol／LNaCI的洗脱缓冲液连续梯度洗脱目的蛋白。 　　1.2.4C383A性质研究 　　1.2.4.1动力学参数测定　根据米氏方程利用双倒数法测定Km及V…，用马尿酰－L－精氨酸为底物(0.05-0.3 mmol／L)，测定条件均为25℃，至少重复3次。 　　1.2.4.2温度对酶活性的影响　底物溶液分别在4，25，30，40，50，60，70，80℃预置5 rain，然后分别加入酶液测活性。以底物温度25℃的酶活性为100％计算相对酶活性并与野生型比较。 　　1.2.4.3温度稳定性将纯化后浓度1 mg／mL的酶液分别置于4，25，30，40，50，60，70，80℃水浴中，每隔相同时间取样测定活性，以水浴前的酶液活性为100％计算残余酶活性并与野生型比较。 　　1.2.4.4最适pH底物分别溶解于pH 3.0～12.0的缓冲液中，于25℃测定纯化后的酶液活性。25 mmol／L醋酸.醋酸钠缓冲液(pH 3.0-6.0)，磷酸盐缓冲液(pH6.5～7.5)，Tris―HCl缓冲液(pH 8.0～8.5)，Gly―NaOH缓冲液(pH 9.5-12.0)，pH均在25℃配制。