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重组黏质沙雷菌脂肪酶可溶性表达及其性质研究 　　摘要：目的提高重组黏质沙雷菌ECUl010脂肪酶(GST-lipase)可溶性表达量，研究其相关理化性质。方法PCR扩增lipase基因，与表达载体pGEX-4T-1连接后转入E.coli BL21(DE3)，优化培养提高可溶性表达量，表达产物用GST亲和层析柱纯化。研究温度、pH等对酶活性的影响，重组酶的底物特异性以及对(±)-MPGM的手性拆分。结果优化后可溶性酶的活性可达8612.3U/L，纯化9.8倍后比活性为3.3U/mg。重组脂肪酶的最适反应温度为30℃，最适pH为9.0。温度低于30℃、pH 6.0～6.8的条件下比较稳定。Ca2+，Fe2+等金属离子和一些非离子表面活性剂能提高酶的活性。硝基苯月桂酸酯(C12)是其最适底物。以(±)-MPGM为底物，4h后转化率达到47.3％，ee值为89.7％。结论优化后可溶性脂肪酶的活性大大提高，研究了重组脂肪酶的相关性质，为地尔硫革的工业化生产奠定了基础。 　　关键词：黏质沙雷菌ECU1010；脂肪酶；可溶性表达；纯化；性质；手性拆分 　　中图分类号：Q556 　　文献标识码：A 　　文章编号：1672-979X(2010)03-00077-06 　　 　　脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，它可将中长链甘油三酯催化水解成甘油和脂肪酸，也可以催化酯类合成和酯交换反应，并且在非水溶剂体系中具有高度的区域选择性和立体选择性。因此，脂肪酶在食品工业、生物洗涤剂，医疗和亲脂性精细化学品的酶法生产方面发挥着重要作用。 　　相比其他的细菌脂肪酶，黏质沙雷菌ECU1010(Serratia marcescens ECU1010)脂肪酶因其潜在的医药应用价值而备受关注。黏质沙雷菌脂肪酶可以高效地选择性拆分地尔硫革(Diltiazem)生产中的关键中间体――消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯(MPGM)，得到(2R，3S)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯――(-)-MPGM，后者作为起始合成原料可以直接合成手性顺式(+)地尔硫革。近年，日本科学家将黏质沙雷菌Sr41 8000的脂肪酶基因以及与分泌相关的蛋白基因分别连接到载体pUC19上，再导回野生型菌株，使酶产量增加近140倍。之后他们将该脂肪酶固定在膜反应器上用于拆分MPGM，获得了较好的效果。但是目前尚未实现以E.coli为宿主规模生产有生物活性的脂肪酶。一方面是因为蛋白质??降解或错误折叠，另一方面，外源蛋白质不断在细胞质中积累，对宿主细胞产生毒性作用，导致其死亡。因此，如何提高脂肪酶的可溶性表达量引起我们的极大兴趣。本文从黏质沙雷菌ECU1010的脂肪酶基因出发，研究了克隆、融合表达、纯化及重组酶的相关性质，为药用地尔硫革规模化生产打下了坚实的基础。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　菌株和材料 　　E.coli BL2l(DE3)、表达载体pGEX-4T-1(Novagen公司)；S.marcescens ECU1010(本实验室保存)：Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、质粒PMD18-T、限制性内切酶、DNA Marker(宝生物工程有限公司)；IPTG，即异丙基硫代半乳糖苷、氨苄青霉素(Sigma公司)；谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱(北京Wsac联合有限公司)；各种硝基苯酯均由硝基苯酚和脂肪酸合成；其他生化试剂均为国产分析纯。 　　 　　1.2　脂肪酶基因的克隆和表达 　　PCR扩增脂肪酶的基因。正向引物为5-ggcgaattcatgggcatctttagctataagg-3(下划线是EcoRI酶切位点)，反向引物为5-atagcggccgcRaggccaacaccacct-3(下划线是NotI酶切位点)。将PCR产物连接到pMD18-T载体并测序。把经测序验证的重组质粒用EcoRI和NotI双酶切后电泳回收DNA片段，用T4DNA连接酶连接到同样双酶切的pGEX-4T-1中，构建表达质粒pGEX-4T-1-1ip。 　　重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，37℃条件下于100 mL LB培养基(1％蛋白胨，酵母膏0.5％，1％氯化钠，pH 7.0)中二级培养至A600=0.8～1.0，加入终浓度分别为0.2mmol/L、5mmol/L的IPTG和Ca2+，并在15℃条件下诱导表达12h，离心收集菌体。 　　 　　1.3　重组脂肪酶的分离纯化 　　用谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析的方法进行纯化。将菌体沉淀重悬于20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，洗涤并离心去除上清液，重复2次。然后将沉淀和细胞碎片重悬于10 mL结合缓冲液(5