制备液相色谱中整体卵白高效快速分离新策略.pdf

摘 要 随着蛋白质组学研究热潮的到来，对于整体活性蛋白的分离和制备已成为影响蛋白 质组学研究向纵深发展的一大难题。一方面，为获得更多蛋白质的结构与功能信息，必 需足够量的高纯度的活性蛋白；另一方面，应用蛋白质组学研究成果开发与生产活性蛋 白质药物急需高效的分离技术并降低生产成本。因此，研究制备规模下整体蛋白快速、 高分辨分离的新策略是解决上述问题的关键。本文首次提出了制备色谱中蛋白分离的五 “S策略，即使用短柱(Shortcolumn)装填小颗粒填料(Small particles)，在单位柱 area OVerload) 横截面上(cross—Sectionalunit)样品较小的质量过载(Small per sample low 和适宜的低线流速(Smtable 绪论。介绍了整体蛋白分离与制备的意义、分离技术和液相色谱分离介质的研究进 展；对色谱饼及其用于蛋白分离的理论、技术和应用的研究作了回顾；简述了制备色谱 的发展及其与分析色谱的异同，引用文献150篇。 实验部分。包括了本文中所用的仪器、材料、实验方法。 整体蛋白液相色谱分离的五“S策略。全面比较了色谱柱和色谱饼分离整体蛋白 时的分离度与峰容量；在分析规模下短色谱柱(色谱饼)和常规长色谱柱上这两者相当， 在制备规模下，同样柱体积的色谱饼分离效果优于色谱柱；装填较细硅胶基质填料的色 谱饼在分离制备蛋白时能取代“软基质的商品填料。基于此首次提出了制备色谱中蛋 白快速、高分辨分离的五“S刀策略。 ： 五“S一策略与热力学因素。对生物大分子的色谱保留行为进行了研究，发现其在 液相色谱分离过程中存在洗脱浓度窗口，用计量置换保留理论对此进行了解释。通过对 溶质与固定相、流动相之间分子相互作用机理的探讨，阐明了溶质在色谱柱床上复杂的 吸附、解吸附过程及其内在特点。提出条件分离度、有效柱长比和单位横截面积的样品 负载密度三个新概念，用来解释超载状态下蛋自在色谱柱床上具有优异分离性能的原 因。阐明了在此条件下提高蛋白分离度的有效途径为增加柱内径，降低柱床上样品吸附 层的厚度和样品负载密度，同时为增大高流速下蛋白的产量应适当减小柱长；表明色谱 饼是实现五“S策略的首选柱技术。 五“S乃策略与动力学的影响。分别考察了不同粒径的色谱填料、填充方式和色谱 柱特征对蛋白分离和谱带扩展的影响。随着填料粒径的减小，蛋白的分离效果逐渐变好， 色谱饼的几何结构使得其填料装填密度要高于同体积的常规色谱柱，并因此减弱了蛋白 的谱带展宽。研究不同流速下蛋白的分离，以条件塔板高度对流速作图，表明色谱饼具 有比色谱柱较小的最佳线流速和较宽的最佳流速范围。提出以条件分离度与流速关系曲 线确定和表征色谱分离的优化条件。在色谱饼上对标准蛋白进行了高效快速分离的优 化，与文献对比，色谱饼的样品负载量大，分离效果好，质量回收率和回收样品浓度高。 五“S策略的应用。用疏水色谱饼在6min内实现了人血清样品的一步快速分离 制备。采用基于色谱饼的二维液相色谱成功实现了不同色谱模式之间缓冲溶液交换和人 血清样品在70rain内快速在线二维分离，在2cm色谱饼上一次样品处理量为40 mg总 蛋白。 关键词：制备色谱，色谱饼，整体蛋白，条件分离度，五“S”策略，人血清，二维液 相色谱 Abstract of in and Withthe research,theseparation greatinterestingproteomics com