细胞免疫荧光技术PPT.ppt

细胞免疫荧光技术 实验目的 掌握免疫荧光技术的基本原理 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果 实验原理 原位检测 抗原抗体特异反应 间接法 间接荧光抗体染色法示意图 抗原 抗体 荧光素标记的抗抗体 激发光 显示荧光 Hela细胞 Vinculin 实验用品 试剂： 固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4 材料： Hela细胞 细胞培养皿 仪器： 荧光显微镜 实验步骤 一，细胞制备和细胞固定 将细胞铺在 24孔板中 将细胞培养 至所需密度 加入4%PFA 固定10min 染色 或保存 PBS洗涤 PBS洗涤 实验结果 三，观察 ?human HeLa cells 实验中应注意的问题 细胞不要铺的过密:60-70% 防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗 1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术 标记物 使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质 免疫细胞化学技术 免疫细胞化学技术注意事项 选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶 封闭液的选择 设定对照实验 思考题 检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？ A 疑难解答 一，缺乏染色 可能的原因 无抗原 抗体失效 固定不充分 过度固定 抗原修复无效 不兼容的二抗和一抗 漏用试剂或未按正确的顺序 加入试剂 相应的措施 用原位杂交方法检测蛋白表达 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 增加固定时间或改用不同的固定剂 减少固定时间;抗原修复 增加修复时间或更换修复液 使用可以与一抗结合的二抗 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序 二，高背景 可能的原因 一抗或二抗的浓度过高 一抗和/或二抗与组织的 非特异性结合 组织过于干燥 试剂粘附在旧的 或未制备好的玻片上 相应的措施 预实验摸索最佳浓度 一抗孵育前封闭 (最好是二抗来源的血清) 在染色过程中避免组织干燥 用新鲜制备或购买的玻片进行实验 三，细胞/组织的形态被破坏 可能的原因 抗原修复方法过于剧烈 组织切片从玻片上脱落 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 组织形态难以分辨 组织固定不充分,自发裂解 相应的措施 预实验摸索合适的修复条件 增加固定时间;烤片; 使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例; 将组织切得较小 Vinculin,是一种细胞骨架蛋白，兼细胞黏着斑蛋白的重要成分,主要分布于细胞与细胞连接，细胞与细胞外基质黏着斑部位，通过与细胞骨架蛋白和黏着斑蛋白以及细胞骨架F肌动蛋白相互作用，在细胞粘附，伸展运动及迁移等过程中起重要作用。 方法的选择:两种蛋白或多种蛋白共标选择免疫荧光;石蜡标本最好酶标,冰冻切片免疫荧光.因为石蜡会有自发荧光,脱不干净,背景较深. 材料留好:石蜡标本,固定:4%PFA或福尔马林固定后转75%酒精保存;冰冻标本:新鲜标本可直接冰冻,也可固定后蔗糖脱水后冰冻. 抗体:最好选择单克隆抗体,参考分值较高的文章,新抗体预实验摸索最适浓度.两种蛋白共标时一抗种属要分开,二抗颜色要分开. 标记物:肠内膜/肾脏/子宫内膜/卵巢膜等含碱性磷酸酶较高,避免标记碱性磷酸酶;肝/脾血细胞/肾等含生物素较多,避免标记生物素.肝/肾/心/肺等含辣根过氧化物酶,但可用双氧水去除内源性HRP. 对照试验:阴性对照:不加一抗,每次实验都应做.阳性对照:反复做都是阴性结果,考虑做阳性对照. 免疫细胞化学四种技术，表达荧光标记重组蛋白 * 好的结果应该是背景较干净,阳性信号特异 上面两幅为肝癌冰冻切片,左图由于冰冻切片制作过程中冰晶的形成将组织结构破坏