基因组编辑技术PPT课件.ppt

CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用 1. DNA片段靶向删除 2. DNA片段靶向反转 3. DNA片段靶向重复 4. DNA片段靶向插入 5. 染色体靶向易位 基因组编辑 应用基因编辑技术不长角的奶牛 基因编辑的定义： 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。 基因编辑的优势 与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。 基因编辑原理 现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组修复(HDR) 两条途径。 第一代: ZFN(锌指核酸酶) 第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶) 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列) 第四代：NgAgo - gDNA 韩春雨 基因编辑发展史 ZFN 基因组编辑技术 ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。 1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块。 1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。 2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。 ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的发展潜力。 缺点: (1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。 TALEN 基因组编辑技术 2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。 TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为12~20 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。 目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。 CRISPR /Cas9 基因组编辑技术 CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者首次在大肠杆菌(E. coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的序列。 2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，现有测序结果显示40%的细菌基因组中含有CRISPR位点。 2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/ Cas 是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。 2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR转录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crRNA经过加工形成含有与外源基因匹配序列的 crRN